论文部分内容阅读
目的:骨肉瘤是一种恶性原发性骨肿瘤,多见于13-19岁的青少年儿童,具有病情进展快、易向肺部转移、预后不良等特点,男性较女性更易发病,目前临床主要采用新辅助化疗联合手术治疗、放疗、靶向治疗、基因治疗,以及免疫治疗等手段治疗骨肉瘤,疗效迅速,效果显著。然而,以上方法手段在高效迅速治疗骨肉瘤的同时,其局限性也在日益暴露突出,因此,有必要寻找更加安全有效的治疗骨肉瘤的方法。穿心莲作为抗肿瘤中药中的代表性药物,其主要成分穿心莲内酯(AG),近年来国内外已经有许多研究表明其有抗肿瘤作用。然而,目前鲜有关于AG能够对骨肉瘤有影响的报道。鞘脂代谢是人体内重要的脂质代谢途径,能够影响人体内多种生物学活动。虽然有研究表明,骨肉瘤与鞘脂代谢有关,然而尚无AG对鞘脂代谢有影响的报道。我们的研究旨在探究AG对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的影响,并通过进一步探讨AG对人骨肉瘤细胞的具体影响和作用机制,进而揭示AG可能影响人骨肉瘤细胞的信号通路,从而发现AG作用于骨肉瘤的可能靶点,为临床治疗骨肉瘤提供新的选择和新的思路。方法:正常培养的人骨肉瘤细胞为对照组(AG浓度为0),分别含有5、10、20、50、100μM AG培养基作用的人骨肉瘤细胞为实验组。通过计数细胞密度并计算人骨肉瘤细胞的生存率(实验组细胞密度/对照组细胞密度×100%)检测AG对各组生存能力的影响;平板克隆实验检测AG对各组增殖能力的影响;Transwell小室实验检测AG对各组侵袭和迁移能力的影响;流式细胞术检测AG对各组细胞周期分布的影响;Western blot实验检测AG对各组鞘氨醇激酶1(SphK1)和黏着斑激酶(FAK)表达水平的影响。结果:(1)在AG作用时间相同的前提下,与对照组相比,各实验组人骨肉瘤细胞的生存率均出现明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.01),结果呈现浓度依赖性;同时,在AG浓度相同的前提下,AG作用时间越长,人骨肉瘤细胞的生存率越低,结果呈现时间依赖性。(2)当AG浓度分别为0、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM时,人骨肉瘤HOS细胞的集落数依次为33.33±2.52、25.00±2.00、21.67±2.08、14.67±2.08、5.67±1.53、6.00±1.00,人骨肉瘤U2OS细胞的集落数依次为53.33±1.53、33.67±1.53、26.33±1.53、23.67±1.53、14.67±2.52、13.00±2.65,提示AG浓度越高,人骨肉瘤细胞的集落数越少,差异均有显著统计学意义(P<0.01),结果呈现浓度依赖性。(3)对照组和实验组HOS细胞的相对侵袭率分别为1.00±0.00和0.40±0.03,对照组和实验组U2OS细胞的相对侵袭率则分别为1.00±0.00和0.24±0.02,与对照组相比,实验组人骨肉瘤细胞的侵袭能力明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)对照组和实验组HOS细胞的相对迁移率分别为1.00±0.00和0.22±0.02,对照组和实验组U2OS细胞的相对迁移率分别为1.00±0.00和0.14±0.01,与对照组相比,实验组人骨肉瘤细胞的迁移能力明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)与对照组相比,各实验组人骨肉瘤细胞的细胞周期分布均出现明显变化,HOS细胞系中,随着AG浓度的变化,G1期比例增加,S期比例无明显变化规律,G2期比例降低,差异均有显著统计学意义(P<0.01);U2OS细胞系中,随着AG浓度的变化,G1期比例增加,S期比例降低,G2期比例降低,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。(6)HOS细胞中,对照组和实验组SphK1的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.81±0.02;U2OS细胞中,对照组和实验组SphK1的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.83±0.02,与对照组相比,实验组人骨肉瘤细胞中SphK1的表达水平均出现明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。(7)HOS细胞中,对照组和实验组FAK的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.14±0.02;U2OS细胞中,对照组和实验组FAK的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.21±0.01,与对照组相比,实验组人骨肉瘤细胞中FAK的表达水平均出现明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1.AG对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞均具有杀伤作用,且呈现出时间依赖性和浓度依赖性。这具体体现在AG能够抑制人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的增殖、侵袭和迁移能力三个方面。2.AG能改变人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的周期分布,增加G1期比例,这进一步印证了AG能够抑制人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的增殖能力。3.AG能够降低人骨肉瘤HOS和U2OS细胞中SphK1和FAK的表达水平,影响人骨肉瘤HOS和U2OS细胞中的鞘脂代谢,抑制SphK1通路,这可能与AG对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的杀伤作用有关。