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目的为了增加抗肿瘤药物的主动靶向性,降低药物毒副作用,同时克服白血病的多药耐药(MDR),我们研制了一种既能特异性定位于肿瘤细胞膜受体又能阻止药物外排的新型多聚物载药纳米粒——转铁蛋白(Tf)修饰的共载化疗药物柔红霉素(DNR)和中药耐药逆转剂汉防己甲素(Tet)的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇(PLGA-PLL-PEG)多聚物纳米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tfo方法合成PLGA-PLL-PEG多聚物并进行结构分析,以单载DNR的多聚物纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG为先行试验基础,摸索合成工艺,进一步制备共载DNR及Tet的多聚物纳米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG,最后共价连接肿瘤细胞膜表面高表达的转铁蛋白受体(TfR)的靶向配体Tf,形成靶向肿瘤细胞的载药多聚物纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf及DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf。通过核磁共振氢谱、激光粒度仪、高效液相色谱仪、凝胶渗透色谱、高分辨扫描电镜等对制备的纳米粒进行物理表征,通过体外透析试验了解载药纳米粒的释药特性,采用药物抑制试验评估空白纳米粒的安全性以及载药纳米粒在体外对人白血病敏感细胞株K562细胞和耐药细胞株K562/ADR细胞的抑制作用,流式细胞技术检测细胞凋亡率和细胞内DNR的含量,荧光显微镜观察柔红霉素在细胞内的分布,qRT-PCR和Western blotting分析TfR基因和蛋白、mdrl/P-gp以及凋亡相关基因和蛋白的转录和表达。结果1、成功合成的PLGA-PLL-PEG多聚物产率较高(61±14%)、结构明确。以其作为载体制备的靶向载药多聚物纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf,扫描电镜下呈球形或近似球形,粒径分别为229±19 nm和213±12 nm,Zeta电位分别为-18.74±0.28 mV和-19.16±0.31 mV。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf的DNR载药量为5.21±0.11%,Tf含量为2.43±0.26%；DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的载药量分别为DNR 3.63±0.15%和Tet 4.27%±0.12%,T晗量为2.18%±0.11%。Tf偶联反应前后药物含量测定结果显示：反应过程中纳米载体所携载的药物稳定,没有泄漏现象。体外释放实验显示：DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf、 DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的药物释放呈双相性模式,在最初8h存在突释现象,分别释放出52.93±3.76%的DNR,50.47±3.74%的DNR和47.86±2.42%的Tet,此后呈现良好的缓释特征,释放时间超过一周。2、对于敏感细胞株K562细胞,靶向载药纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR的抑制作用均随着浓度的增加而增强,DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf的IC50值低于DNR(0.91土0.10 gg/mlvs 1.31±0.24 gg/ml),差异有统计学意义。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR对K562细胞的凋亡率分别为50.24土3.40%和40.78±1.10%,显著高于Con组(P<0.05),DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf诱导细胞凋亡的能力较DNR强(P<0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR处理K562细胞后,细胞胞浆胞核均可见较多的DNR分布及明显细胞凋亡的特征性改变,如核固缩、核碎裂、核溶解。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf能显著上调K562细胞tfr基因的转录及TfR蛋白表达(P<0.05)。3、对于耐药细胞株K562/ADR细胞,无论DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf或是DNR和Tet的混合水溶液(DNR/Tet)的抑制作用亦均随着浓度的增加而增强,DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的ICso值(为DNR和Tet的总药量之和)低于DNR/Tet(0.87±0.01 gg/mlvs1.47±0.]5 μg/ml),差异有统计学意义。加入耐药逆转剂Tet后,DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf较DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf能显著增加细胞凋亡率(58.21±2.71%vs8.84±0.24%)及细胞内DNR浓度(RFI：37.96±0.42vs16.37±0.64)(P<0.05)。与DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG相比,载体经Tf修饰后,DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf更能增加细胞凋亡率(58.21±2.71%vs 33.41±3.03%)及细胞内DNR浓度(RFI：37.96±0.42vs27.19±1.17)(P<0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG组、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tfi组和DNR组中DNR主要分布于细胞浆,DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG组、DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf组和DNR/Tet组中DNR主要分布在细胞浆和细胞核内。DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG、 DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf、 DNR/Tet组细胞中均可见到细胞凋亡的特征性改变,如核固缩、核碎裂、核溶解。DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf能显著上调K562/ADR细胞tfr基因的转录和TfR蛋白表达(P<0.05)；下调K562/ADR细胞mdrl mRNA的转录和P-gp的表达(P<0.05);上调Caspase 3和Bax的基因转录和蛋白表达(P<0.05),下调Bcl-2、Survivin和NF-κB的基因转录和蛋白表达(P<0.05)。结论1、合成的多聚物纳米粒PLGA-PLL-PEG可携载多种药物,末端经Tf修饰,可形成具有主动靶向性能的纳米载体PLGA-PLL-PEG-Tf,粒径均一并具有缓释特点。2、单载柔红霉素的靶向载药纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf对人白血病敏感细胞株K562细胞有明显的细胞毒性,可能通过细胞内吞作用将药物转运至胞浆内,并缓慢释放药物进入细胞核从而诱导凋亡。同时可能通过上调细胞表面tfr的基因转录和TfR蛋白表达,进一步促进TfR介导的药物内吞作用。3、共载柔红霉素和汉防己甲素的靶向载药纳米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf在体外对人白血病耐药株K562/ADR细胞有生长抑制作用,可通过下调细胞mdr1/P-gp表达减少DNR的外排作用增加药物蓄积,上调Bax/Bcl-2比值和Caspase3的基因转录和蛋白表达、下调Survivin和NF-κB的基因转录和蛋白表达,从而增强对耐药细胞的促凋亡作用。DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf还可能通过上调tfr基因转录和TfR蛋白表达进一步促进TfR介导的药物内吞作用。4、 PLGA-PLL-PEG-Tf靶向纳米药物载体是一种有潜力应用于治疗白血病或其他恶性肿瘤的新型、通用的主动靶向载体平台。