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糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)是由糖尿病引起的肾脏损害,是糖尿病的微血管病变并发症之一。在全球范围内,DKD己经成为终末期慢性肾脏病的首位病因,绝大多数是不可逆转的,临床上防治只能延缓其病程进展,不能彻底根除,已成为影响人类健康和生活质量的全球公共卫生问题。WHO数据显示,目前全球有超过三亿糖尿病病人,其中40%将在未来一年内进展为终末期肾脏病[1]。DKD的高发也带来了医疗资源的巨大消耗。统计数据显示:1998年,美国用于治疗DKD的医疗费用投入为160亿美元,而2010年这一数字增长为390亿美元。目前,DKD己经成为一个公共卫生和社会问题,严重威胁着人们的身心健康。新近的研究发现,Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)介导的肾小管上皮细胞炎症因子的分泌是DKD的重要致病因素。多功能蛋白SQSTM1/p62(以下简称p62)可与TLR4通路中的TRAF6直接结合,进而对TLR4信号通路发挥调节效应,我们的实验研究发现,在高糖环境下肾小管上皮细胞p62表达水平降低,而p62是否参与了 DKD肾小管上皮细胞TLR4通路的过度激活,进而参与肾小管上皮细胞分泌炎症因子的调控,这些目前尚不清楚。我们通过体外培养肾小管上皮细胞株HK-2,体外高糖刺激HK-2细胞72小时后发现,肾小管上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10表达水平与对照组相比升高,细胞纤维化指标E-钙粘蛋白(E-Cadherin)表达降低、波形蛋白(Vimentin)的表达升高,p62表达水平降低。体内糖尿病小鼠肾小管上皮细胞p62表达也降低,伴随EMT增强,TLR4信号通路被激活。而过表达p62能够部分逆转高糖引起的肾小管上皮细胞的炎症因子分泌和EMT。本研究表明p62有可能成为一个有效干预靶点,通过调控TLR4通路对DKD起保护效应。本研究对于深入理解DKD肾小管上皮细胞TLR4通路激活的细胞内机制,以及为临床治疗寻找DKD新的干预靶点具有重要意义。研究目的1.糖尿病环境下肾小管上皮细胞HK-2细胞p62异常表达是否参与高糖诱导下的肾小管上皮细胞TLR4信号通路的过度激活,深化对DKD肾小管间质炎症发生发展机制的认识。2.上调或下调p62的表达能否通过调控肾小管上皮细胞TLR4信号通路对DKD的病程的发生发展产生影响。研究方法:1.人肾小管上皮细胞HK-2慢病毒包装质粒过表达p62,按Invitrogen公司Lipofectamine 3000使用说明进行共转染HK2细胞,用实时定量PCR及免疫印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测p62的转染基因效率。2.收集细胞总蛋白后,用免疫印迹法检测细胞纤维化指标(EMT)E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白Vimentin的表达和TLR4信号通路相关分子TLR4、TRAF6的水平。3.TRIZOL法提取培养细胞总RNA,逆转录合成cDNA,应用实时定量RT一PCR检测细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA的表达。在HK-2细胞中过表达p62后,加高糖刺激72h,收集上清液采用BD Milliplex试剂盒用Luminex检测 IL-1β、IL-6、IL-104.在高糖环境下培养肾小管上皮细胞,用免疫共沉淀方法检测p62和TRAF6相互作用能力。在HK-2细胞中过表达p62后,加高糖刺激72h,收集上清采用BD Milliplex试剂盒用Luminex检测IL-1β、IL-6、IL-10。STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏匀浆提取RNA,qPCR检测糖尿病小鼠p62的mRNA表达水平。肾脏匀浆提取总蛋白,western blotting显示糖尿病小鼠p62的表达水平。肾脏石蜡切片免疫组织化学染色显示在肾小管区域p62的表达水平。研究结果:1.在高糖刺激肾小管上皮细胞72小时后,肾小管上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10表达水平与对照组相比升高,细胞纤维化指标E-钙粘蛋(E-Cadherin)表达降低,波形蛋白(Vimentin)的表达升高,TLR4和TRAF6的表达水平升高。2.糖尿病鼠肾小管上皮细胞EMT增强,TLR4信号通路被激活。3.糖尿病情况下,p62表达水平降低,p62和TRAF6相互作用阻断了 TLR4信号通路的过度激活。4.过表达p62能够抑制高糖刺激导致的HK-2细胞的EMT转化和炎症因子的分泌。研究结论:1.在高糖环境下肾小管上皮细胞p62水平降低。2.p62作为一种下游机制参与了 DKD肾小管上皮细胞TLR4通路的过度激活,作为一种下游机制参与了 DKD肾小管上皮细胞TLR4通路的过度激活。3.p62能成为一个潜在的干预靶点,通过调控TLR4通路对DKD的病情进展起保护作用。