阿魏酸酯酶是一类水解酶，能够降解植物细胞壁中阿魏酸与木质素及阿拉伯半糖相交联的酯键。阿魏酸酯酶同其它纤维素酶如木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等具有协同作用，共同作用植物细胞壁时，能使其高效降解。利用阿魏酸酯酶，可以降低生产工艺中采用化学法所带来的环境问题，因此在造纸、纺织、饲料、食品等轻工行业具有广泛应用前景。阿魏酸酯酶作用底物产生的阿魏酸作为一种天然抗氧化剂，在食品、保健品和化妆品的应用中具有巨大潜力。本论文的研究目的是通过分子生物学方法，构建产阿魏酸酯酶工程菌株，提高阿魏酸酯酶的产量。具体研究内容和方法如下：　　本实验设计从两株出发菌中获得阿魏酸酯酶基因，首先利用本实验室前期筛选出一株产阿魏酸酯酶的细菌A216，本文中对其进行了形态学、生理生化以及分子生物学方面的鉴定，结果表明这是一株Burkholderia fungorum，实验中获得的16S rDNA序列和ITS序列，提交Genebank数据库分别获得注册码KJ026454和KJ130021。鉴于目前没有B. fungorum产生阿魏酸酯酶的研究报道，以及阿魏酸酯酶基因序列的不保守性，拟利用构建基因组文库的方法获得其阿魏酸酯酶编码基因。利用Sau3AⅠ部分酶切B. fungorum A216基因组DNA，回收300-4000 bp片段。用BamHⅠ酶切载体pUC19，SAP去磷酸化，回收线性载体片段。将基因组片段与载体按摩尔比例10:1连接，转化DH5α感受态细胞，并将其涂布于含有阿魏酸乙酯的平板，对获得的基因组文库进行筛选。结果获得文库库容32000个克隆，插入率96％，平均插入片段2000 bp，能够包含B. fungorum A216全部的基因组信息。但是通过这种透明圈筛选法，没有获得B. fungorum A216编码阿魏酸酯酶的序列。其次选择实验室前期筛选出的另一种阿魏酸酯酶产生菌土曲霉作为出发菌株，利用重叠拼接PCR方法获得了其编码阿魏酸酯酶的序列。　　为了开展下一步的异源表达实验，利用获得的土曲霉阿魏酸酯酶基因编码序列，分别在原核表达宿主大肠杆菌和真核表达宿主毕赤酵母中进行了异源表达。大肠杆菌异源表达中，利用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切阿魏酸酯酶的DNA和表达载体pET-22b(＋)，连接后成功构建了表达载体pET22b-fae，此表达载体成功转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化子发酵产物酶活测定结果显示阿魏酸酯酶成功表达，SDS-PAGE表明异源表达的阿魏酸酯酶大小为32 kDa。在LB培养基中对此大肠杆菌转化子发酵条件进行了优化，结果在接种1％的种子液下，37℃培养4 h后，添加IPTG终浓度至0.01 mM，于30℃诱导9 h后获得最高酶活420 mU/mL，优化后产酶量为出发菌株土曲霉的28倍。以阿魏酸对硝基苯酚酯(4-NPF)为底物，大肠杆菌转化子产阿魏酸酯酶最适反应温度为50℃，温度稳定性为在60℃半衰期为6 min，55℃半衰期为15 min，50℃半衰期是4 h，45℃半衰期为18 h，温度低于40℃时有较好的稳定性，最适pH值为6.8，pH稳定性为在pH6-10的范围内保存24 h后，酶活仍大于70％。　　在毕赤酵母异源表达过程中，利用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切阿魏酸酯酶的DNA和表达载体pPICZαA，连接后成功构建了表达载体pPICZαA-FAE，此表达载体经SacⅠ线性化后电转化感受态毕赤酵母GS115菌株，然后在含有博来霉素Zocin的平板上进行筛选，平板上长出的转化子经PCR验证，表明阿魏酸酯酶基因插入成功，然而SDS-PAGE实验和酶活测定实验均没有检测到目的蛋白的表达。其可能原因为转录 RNA的空间结构阻碍了目的基因的翻译，下一步可以利用转化子通过RT-PCR方法进行分析检测。