线粒体是真核细胞内重要的产能细胞器，参与细胞增殖、代谢、分化、信号传递、凋亡等多种细胞生理活动。细胞凋亡与胚胎发育、维持体内细胞数量的动态平衡和重要人类疾病如肿瘤的发生发展密切相关。线粒体凋亡通路一般分为三个阶段过程。在中央调控阶段，线粒体通过释放细胞色素C发挥重要作用。据报道，Bcl-2凋亡蛋白家族成员Bax和Bak通过定位于线粒体膜参与细胞凋亡过程。因此，研究线粒体相关蛋白对于深入理解细胞凋亡和肿瘤发生的分子机制具有重要意义。　　Rap2b是p53的靶基因，属Ras癌基因超家族成员。本课题组前期研究发现，降低胞内Rap2b的表达水平使肿瘤细胞对DNA损伤高度敏感，易于发生细胞凋亡。我们推测，Rap2b可能通过与线粒体膜上的蛋白质相互作用参与细胞凋亡过程。　　在本研究中，首先我们构建了慢病毒重组质粒pLKO.1-TetOn-shRNA，包装慢病毒，用于HCT116结肠癌细胞内Rap2b表达水平的可控敲降，并用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测了Rap2b和促凋亡相关基因如Bax等的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，Rap2b的表达下调后，Bax与Puma的胞内总蛋白水平没有明显的变化，但线粒体中的Bax蛋白水平明显上升。　　接着，我们研究了Rap2b在细胞中的定位。我们先用免疫印迹法检测分离的胞浆和线粒体，发现Rap2b主要存在于线粒体部分。免疫荧光染色实验进一步证明，Rap2b定位于线粒体。　　然后，我们结合pulldown和银染-质谱分析技术筛选与Rap2b发生相互作用的线粒体蛋白。结果显示，Rap2b可能与线粒体特异的HSPA9相互作用。　　最后，我们在体内外验证了Rap2b与HSPA9的相互作用。先将HSPA9和Rap2b基因克隆至原核表达载体pET-32a和pGEX-5X-1中，在BL21(DE3)表达菌中诱导表达，并将纯化的Hi-TrxA-HSPA9蛋白与GST-Rap2b在体外进行pulldown实验。结果显示，Rap2b能在体外与HSPA9直接结合。同时，将Rap2b和HSPA9基因分别克隆至荧光双分子载体pBiFC-mCherry N159和pBiFC-mCherryC160，同时转染细胞，在激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，Rap2b与HSPA9在体内直接相互作用。　　综上所述，Rap2b可能通过与线粒体特异的HSPA9分子相互作用定位于线粒体，并通过调节线粒体上Bax蛋白水平参与细胞凋亡过程。这一发现对深入理解Rap2b的功能及其分子机理具有重要意义。