第一部分新型双向旋转灌注微重力生物反应器研制研究背景肝功能衰竭是各种肝病的终末期表现。患者病情危重,病死率高。肝脏移植手术是目前公认有效的治疗方法。但由于供体缺乏、高额的治疗费用以及患者需长时间服用免疫抑制剂等原因,极大地限制了肝移植手术的广泛开展。以体外培养肝细胞为基础的生物人工肝等治疗手段的出现,有望使部分患者肝功能自行恢复或顺利完成肝移植手术。然而,如何合理设计新型生物反应器,实现体外肝细胞的大规模培养及其培养过程中肝细胞功能与活率的有效维持,仍是目前强烈限制生物人工肝发展的瓶颈问题,也是目前亟待解决的重要课题。生物反应器是整个BAL的核心部分,其性能将直接关系到生物人工肝的支持效果。理想的生物人工肝生物反应器应满足如下条件：1.为肝细胞提供良好生长和代谢环境；2.实现有效的营养物质、氧气及代谢产物双向物质传输；3.保护肝细胞免受体内的免疫损伤；4.可进一步扩大培养规模,满足临床治疗需求；5.最大可能减小反应器内的培养死腔。为此,国内外学者研制出了各种结构形态的生物反应器,主要有四种模式：中空纤维型、单层平板培养型、灌流平板／支架型、包裹式微球／悬液或柱状反应器及其它结构复杂的复合式生物反应器等。虽然经过二十余年发展,已有部分生物人工肝生物反应器已进入临床实验,但目前仍未有一种理想的生物反应器可充分满足临床运用需要。大量研究表明,由美国航空航天局(NASA)设计的50ml小体积旋转式细胞培养系统(The Rotary Cell Culture System,以下简称RCCS-1),由于其独特的低剪切力、高效物质交换,持续模拟微重力培养环境可增强体外培养细胞与细胞间接触,形成三维结构样组织,促进细胞增殖分化,改善及维持体外培养细胞功能,目前已成功广泛地运用于胚胎干细胞、角膜细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞等多个组织工程领域中。为进一步深入研究微重力生物反应器作为一种新型生物人工肝生物反应器的可行性本课题组引进了美国航空航天局(National Aeronautics and Space Administration简称NASA)设计的500ml体积的新型旋转灌注微重力生物反应器(Rotary Culture MWTM,简称RCMW),但经过反复的实验研究表明,美国航空航天局生产的RCMW微重力生物反应器在设计上存在严重的缺陷,完全不能满足生物人工肝生物反应器的需求,为此,本课题拟通过对RCMW微重力生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,设计出一种具有自主知识产权的新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,为新一代生物人工肝生物反应器的发展开辟一个新的方向与思路。研究目的通过对RCMW微重力生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,设计出了一种新型双向旋转灌注式微重力生物反应器。研究方法在美国NASA公司RCMW微重力生物反应器的基础上,通过内芯及循环模式优化构建,形成由流向控制器、细胞培养罐、培养液池、蠕动泵动力系统、膜肺、供气系统组成的新型双向旋转灌注微重力生物反应器系统。人肝细胞(CL-1)在RCMW微重力生物反应器(RCMW组)、外置氧合器RCMW微重力生物反应器(RCMW高氧组)及双向旋转灌注微重力生物反应器(双向反应器组)中,持续微载体三维培养7天,并通过MTT染色、细胞计数、培养上清中ALT、AST、白蛋白、尿素浓度等指标测定,比较各组肝细胞活力、数量和功能差异。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。数据采用重复测量的方差分析,每组不同时间点之间的分析采用单组的重复测量方差分析,同一时间点的不同组别之间采用单向方差分析,当方差不齐时采用Welch方法。多重比较当方差齐性时采用LSD方法,当方差不齐时采用Tamhane’sT2方法。检验水准a=0.05.研究结果美国NASA公司商品化RCMW微重力生物反应器存在微载体/细胞堵塞,双向物质交换效率低下及出现培养死腔等缺点；而改进后双向旋转灌注微重力生物反应器中双向物质交换效率明显提高,微载体/细胞均匀分布于整个培养罐中,不存在培养死腔。倒置显微镜下形态学及MTT细胞活力染色结果可见,双向反应器组人肝细胞(CL-1)的数量与活力均明显优于RCMW组及RCMW高氧组。生长曲线结果显示,RCMW组、RCMW高氧组及双向反应器组人肝细胞密度均为先升高后逐渐下降,分别于第2天、第3天、第5天达肝细胞密度峰值8.8±0.57×105个/ml、12.92±0.98×105个/ml、32.58±1.44×105个ml,且双向反应器组人肝细胞密度于第2至7天均明显高于RCMW组及RCMW高氧组,差异均有统计学意义(P<0.01)。肝细胞功能结果显示,RCMW组、RCMW高氧组及双向反应器组白蛋白、尿素合成功能均为先升高后逐渐下降,分别于第3天、第3天及第5天达峰值,且双向反应器组上清白蛋白、尿素浓度于第1至7天均明显高于RCMW组及RCMW高氧组,差异均有统计学意义(P<0.01)。此外,双向反应器组上清ALT、AST浓度于第1至7天均明显低于RCMW组及RCMW高氧组,差异均有统计学意义(P<0.01)。研究结论本研究通过对RCMW微重力生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,成功设计出了一种新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,可有效解决商品化RCMW微重力生物反应器中存在的各种设计缺点,大大提高体外培养人肝细胞的密度、活率及功能,有望成为新一代生物人工肝生物反应器。第二部分双向旋转灌注微重力生物反应器人肝细胞、肝星形细胞共培养研究研究背景如何能尽最大可能地模拟肝细胞体内生存的微环境,使肝细胞能持续大量增殖分化,保持较高生物活性,且较好地保持肝细胞的各种生物功能是目前限制生物人工肝体外肝细胞规模化培养发展的瓶颈问题。为此,人们不断改进肝细胞体外培养方法。体内肝脏细胞由肝实质细胞和肝窦内皮细胞、肝星形细胞及库否细胞等肝非实质细胞组成。它们在错综复杂的三维细胞外基质中,通过细胞-细胞与细胞-细胞外基质间的相互通讯,精确地发挥着各自特异的生物学功能。这些重要的体内生理调节作用对于体内肝细胞功能与活性具有重要的作用。目前很多肝细胞体外培养研究中都在尝试尽可能地模拟体内这种生理结构,并经过长期的研究已经表明,通过与库否细胞、人脐静脉内皮细胞及成纤维细胞等肝内外非实质细胞共培养,可显著增强并维持体外培养肝细胞的各种肝特异性功能。肝星形细胞位于肝叶Disse间隙内,可合成大量ECM、摄取并贮存维生素A。正常肝组织内星形细胞的数量虽然不多(约占肝小叶的1%),但其细胞表面细长突起和皱折大大增加了其与肝实质细胞微绒毛的接触面,从而形成以星形细胞为中介的三位一体的结构功能单位,称为星形细胞单位。将肝实质细胞和星形细胞混合培养可望获得与肝小叶相似的功能,为生物人工肝提供具有良好生理功能的肝细胞来源。本课题在前期工作中研制成功具有自主知识产权双向旋转灌注微重力生物反应器,与目前现存的其它类型生物反应器培养系统相比,有如下优点：低剪切力,对细胞损伤小：高效的双向物质交换：持续模拟微重力环境有利于细胞增值分化,有利于细胞与细胞间接触,形成三维结构样组织易于细胞规模化培养等优点,现为最大可能地模拟肝细胞体内生存的微环境,使肝细胞能持续大量增殖分化,保持较高生物活性,较好地保持肝细胞功能,本课题拟在前期双向旋转灌注微重力生物反应器微载体人肝细胞的基础上,进一步进行微载体人肝细胞、人肝星形细胞三维共培养研究。研究目的通过人肝细胞、肝星形细胞微载体三维共培养进一步提高肝细胞数量、活力及功能。研究方法人肝细胞在微载体三维静置培养(微载体静置单培养组)、微载体人肝细胞、肝星状细胞三维静置共培养(微载体静置共培养组)、双向旋转灌注微重力生物反应器微载体三维培养(双向反应器单培养组)及双向旋转灌注微重力生物反应器微载体人肝细胞、肝星状细胞三维共培养(双向反应器共培养组)四种不同培养条件下连续培养7天。通过扫描电子显微镜、倒置显微镜观察及MTT染色比较各组肝细胞生长的形态、细胞活力差异,并通过细胞计数、培养上清中ALT、AST、白蛋白、尿素浓度等指标测定,比较各组肝细胞数量和功能差异。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。数据采用重复测量的方差分析,每组不同时间点之间的分析采用单组的重复测量方差分析,同一时间点的不同组别之间采用单向方差分析,当方差不齐时采用Welch方法。多重比较当方差齐性时采用LSD方法,当方差不齐时采用Tamhane’sT2方法。检验水准a=0.05.研究结果倒置显微镜、扫描电子显微镜及MTT细胞活力染色结果可见,微载体静置共培养组及双向反应器共培养组中,多个微载体间借“细胞桥”相互聚集在一起组成较大的微载体细胞组织块,细胞数量及活力均明显优于相应的微载体静置单培养组及双向反应器单培养组。生长曲线结果显示,微载体静置单培养组、微载体静置共培养组、双向反应器单培养组及双向反应器共培养组四组肝细胞密度均为先升高后逐渐下降,四组分别于第3天、第4天、第5天及第5天达峰值：8.22±0.60×105/ml、13.80±1.12×105/ml、32.62±2.51×105/ml和39.38±3.67×105/ml双向反应器共培养组肝细胞峰值密度明显高于其它三组,差异具有统计学意义(P<0.01)。微载体静置共培养组肝细胞密度于第3至7天均明显高于微载体静置单培养组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器共培养组肝细胞密度于第2至7天均明显高于双向反应器单培养组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器共培养组肝细胞密度于第1至7天均明显高于微载体静置共培养组,差异具有统计学意义(P<0.01)。肝细胞功能结果显示,双向反应器共培养组上清尿素、白蛋白峰值浓度明显高于其它三组,差异具有统计学意义(P<0.01)。微载体静置共培养组上清尿素浓度、白蛋白浓度于第2至7天均明显高于微载体静置单培养组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器共培养组上清尿素浓度、白蛋白浓度于第2至7天均明显高于双向反应器单培养组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器共培养组上清尿素浓度、白蛋白浓度于第1至7天均明显高于微载体静置共培养组,差异具有统计学意义(P<0.01)。研究结论1、人肝细胞、肝星形细胞共培养能进一步提高肝细胞的功能表达、延长细胞生长时间。2、双向旋转灌注微重力生物反应器微载体人肝细胞、肝星状细胞三维共培养是维持肝细胞大量增殖分化并保持肝细胞功能一种较为理想的体外肝细胞培养模式。第三部分肝细胞规模化培养保护液的研制研究背景肝细胞是生物人工肝(BAL)系统的核心。生物人工肝(BAL)对肝功能衰竭病人的肝支持作用完全依赖于所用肝细胞的特异性生物学功能。目前认为,生物人工肝要达到理想支持效果至少需要1010以上数量级的细胞,而在保障细胞活性的条件下,肝细胞数量越多,其支持及治疗效果将越佳,因此,肝细胞体外大规模培养技术已成为生物人工肝技术发展的核心技术。虽然肝细胞体外大规模培养技术已取得了许多重大的进展,如新型生物反应器研制及共培养等培养模式优化等,但肝细胞在体外大规模培养过程中仍容易受到氧气营养物质供应不足、代谢产物蓄积等各种因素的损伤,从而导致肝细胞的活性及功能下降。目前研究表明,在肝细胞体外大规模培养过程中,各种损伤因素所引起的肝细胞凋亡正是导致肝细胞活性与功能下降的主要原因。为此,本课题拟通过研制肝细胞规模化培养保护液,有效减轻规模化培养中各种培养环境因素对肝细胞造成的损伤,并抑制肝细胞凋亡的发生,从而达到进一步提高并维持肝细胞规模化培养的密度和功能状态的效果。研究目的研制一种肝细胞规模化培养保护液配方,可在同等条件下有效减轻规模化培养中各种培养环境因素对肝细胞造成的损伤,以进一步提高肝细胞规模化培养的密度和功能状态。研究方法根据国内外研究成果及前期预实验,自行研制出肝细胞保护液配方,成分主要包括黄芪、丹参、果糖、胰岛素及维生素C等。人肝细胞在RCMW微重力生物反应器微载体培养(RCMW组)、RCMW微重力生物反应器微载体培养+肝细胞保护液(RCMW保护液组)、双向旋转灌注微重力生物反应器微载体培养(双向反应器组)及双向旋转灌注微重力生物反应器微载体培养+肝细胞保护液(双向反应器保护液组)四种不同培养条件下连续培养7天,通过倒置显微镜观察及MTT染色比较各组肝细胞生长的形态、细胞活力差异,并通过细胞计数、培养上清中ALT、AST、白蛋白、尿素等指标测定,比较各组肝细胞数量和功能情况。以评价上述保护液配方在RCMW及双向旋转灌注微重力生物反应器两种不同的大体积(500m1)生物反应器中的肝细胞保护效果。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。数据采用重复测量的方差分析,每组不同时间点之间的分析采用单组的重复测量方差分析,同一时间点的不同组别之间采用单向方差分析,当方差不齐时采用Welch方法。多重比较当方差齐性时采用LSD方法,当方差不齐时采用Tamhane’sT2方法。检验水准a=0.05.研究结果倒置显微镜下形态学及MTT细胞活力染色结果可见,RCMW保护液组及双向反应器组肝细胞数量及活力均明显优于相应的RCMW组双向反应器组。生长曲线结果及肝细胞功显示,RCMW组、RCMW保护液组、双向反应器组及双向反应器保护液组四组肝细胞密度均为先升高后逐渐下降,四组分别于第2天、第4天、第5天及第5天达峰值：8.82±0.59×107ml、13.60±1.00×107ml、32.62±2.68x 105/ml和39.9±3.08×105/ml。RCMW保护液组细胞密度于第3至7天均明显高于RCMW组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器保护液组细胞密度于第2至7天均明显高于双向反应器组,差异具有统计学意义(P<0.05)。RCMW保护液组上清尿素、白蛋白浓度于第1至7天均明显高于RCMW组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器保护液组上清尿素、白蛋白浓度于第1至7天均明显高于双向反应器组,差异具有统计学意义(P<0.05)。而RCMW保护液组ALT、AST浓度于第2至7天均明显低于RCMW组,差异具有统计学意义(P<0.05)。双向反应器保护液组ALT、AST浓度于第4至7天均明显低于双向反应器组,差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论本课题组研制的肝细胞规模化培养保护液,可在同等条件下有效减轻规模化培养中各种培养环境因素对肝细胞造成的损伤,以进一步提高肝细胞规模化培养的密度和功能状态。