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目的:本研究通过建立心梗后心衰模型,在“心肾相关”理论指导下应用补肾活血方治疗心衰大鼠,观察补肾活血方对大鼠实验疗效,明确其改善大鼠心室重构作用,并以Wnt/β-catenin信号通路为契合点,从在体及离体两个层面进一步探讨补肾活血方改善心室重构的具体分子机制。材料与方法:1.心梗后心衰大鼠模型建立及评价。购买130只SPF级雄性SD大鼠（体重250±20g）,随机选出30只用于心梗后心衰大鼠模型建立及评价,剩余100只用于后续其他实验。将选出的30只大鼠随机分为假手术组与模型组,每组15只。通过结扎大鼠冠脉左前降支（left anterior descending artery,LAD）造成大鼠大面积心肌梗死,随机选取术后存活大鼠3只,于术后第三天行2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchlor ide,TTC）染色测量大鼠心肌梗死面积,其余术后存活大鼠进行力竭式游泳,1次/日,并减半喂食（按体重计算标准饲料量/2）,持续4周,造成慢性心衰大鼠模型,假手术组大鼠冠脉LAD只挂线,不结扎,术后正常饮食。造模过程中,观察大鼠存活状况,造模结束后计算大鼠存活率,观察两组大鼠体征（包括心率、呼吸频率、尿量等）,采用超声法测量大鼠射血分数（ejection fraction,EF）,称取大鼠体重及心脏重量计算心重指数（heart weight index,HWI）,酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测大鼠血清脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）含量。通过上述方法综合评价心梗后心衰模型制备的可靠性。2.补肾活血方对慢性心衰大鼠心功能及“心肾相关”指标的影响。购买的130只SPF级雄性SD大鼠,上述实验使用30只,剩余100只。在剩余的100只SPF级雄性SD大鼠中随机挑选20只作为假手术组,其余80只大鼠通过结扎大鼠冠脉LAD造成心肌梗死,术后进行力竭式游泳及饥饿,造成慢性心衰大鼠模型（造模操作手法同上述实验）。将造模后存活大鼠随机分为模型组、补肾活血组、赖诺普利组。赖诺普利组大鼠给予赖诺普利片配置成的混悬液2.0mg/kg·d（按人鼠剂量换算）灌胃,每天1次,每次3ml;补肾活血组大鼠给予补肾活血方熬制汤剂灌胃,剂量为18.0g/kg·d（按人鼠剂量换算）,每天1次,每次3ml;假手术组和模型组大鼠每日给予常规等容积蒸馏水灌胃,每天1次,每次3ml。各组均给药4周。药物治疗4周后超声检测各组大鼠舒张末期左心室内径（LVEDD）,收缩末左心室内径（LVESD）并计算EF值及左心室短轴缩短分数（FS）,处死大鼠取材,制作心肌病理切片并采用HE染色法（纵切）观察各组大鼠心肌形态改变,Elisa法测定各组大鼠血清BNP表达水平,免疫蛋白印记（Western blotting,WB）法检测大鼠肾组织中Klotho蛋白表达水平,反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测大鼠肾组织骨桥蛋白（osteopontin,OPN）信使核糖核酸（messenger ribonucleic cid,m RNA）表达情况。3.观察补肾活血方对心梗后心衰大鼠模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大改善心室重构机制。动物造模及药物治疗同上。药物治疗4周后,采用HE染色法（横切）观察心肌横截面面积,Elisa法测定各组大鼠血清Wnt3a表达水平,WB法检测各组大鼠心肌β-连环蛋白（β-catenin）、散乱蛋白1（dishevelled 1,Dvl1）、磷酸化糖原合酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK3β）水平,RT-PCR法检测大鼠心肌组织Myc m RNA表达情况。4.观察补肾活血方对H9C2心肌细胞肥大模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大机制,明确补肾活血方调控Wnt/β-catenin信号通路的主要靶点。含药血清制备:购买20只大鼠,随机选出10只给予补肾活血方熬制汤剂18.0g/kg·d灌胃,每天1次,每次3ml,灌胃1周后取材收集大鼠血清,离心制备补肾活血方含药血清;另外10只大鼠给予等量蒸馏水灌胃,1周后取材收集大鼠血清,离心制备正常大鼠血清。购买H9C2细胞株,根据实验设计分为四组。应用96孔板培养细胞。正常组心肌细胞共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;模型组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;中药组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液;中药实验组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及持续活化型β-catenin质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液。为消除误差,实验另设对照,将上述分组中Top-flash换为Fop-flash。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中48h,应用Dual-Glo?Luciferase Assay System双荧光报告系统检测细胞荧光值。另取24孔板,孔中铺圆形玻片,按上述分组方法培养细胞并转染,转染后取出玻片用显微镜观察心肌细胞面积,鬼笔环肽法观察心肌细胞F-actin荧光强度及细胞形态。结果:1.造模完成时,模型组大鼠死亡4只,LAD结扎后大鼠心电图显示ST段明显抬高,幅度超过0.1m V;TTC染色显示术后大鼠心肌梗死面积为39.46%。造模结束时模型组大鼠心率、呼吸频率高于假手术组,尿量少于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠EF均值低于45%,低于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠心重指数高于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠血清BNP、Ang Ⅱ水平明显高于假手术组（P﹤0.01）。2.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,EF、FS值降低,血清BNP水平明显升高,心肌结构紊乱,部分胞核溶解,肾组织Klotho蛋白表达降低,OPN m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组大鼠比较,补肾活血组大鼠LVEDD、LVESD降低,EF、FS值升高,血清BNP水平明显降低,心肌结构改善,肾脏Klotho蛋白表达升高,OPN m RNA表达降低（P﹤0.01）;与赖诺普利组比较,补肾活血组大鼠超声指标、肾组织Klotho蛋白及OPN m RNA表达无差异（P﹥0.05）。3.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠心肌横截面面积增大,Wnt经典通路配体Wnt3a血清水平降低,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显升高,心肌组织Myc m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组比较,补肾活血组及赖诺普利组大鼠心肌横截面面积变小,血清Wnt3a水平升高,心肌组织Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显降低,心肌组织Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）,补肾活血组心肌组织β-catenin表达较高（P﹤0.01）,赖诺普利组心肌组织β-catenin蛋白表达变化不明显（P﹥0.05）;与赖诺普利组相比,补肾活血组大鼠心肌横截面面积无差异（P﹥0.05）,血清Wnt3a水平较高,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达较低,Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）。4.显微镜下观察正常组H9C2细胞,可见细胞多呈长梭形。模型组H9C2细胞面积增大,F-actin荧光强度明显高于正常组（P﹤0.01）,细胞内微丝增多增粗,细胞横向增宽,形态不规则,提示H9C2细胞肥大模型成功,双荧素酶报告系统显示模型组H9C2细胞荧光值明显高于正常组（P﹤0.01）;相比于模型组,中药组H9C2细胞面积缩小,细胞多呈梭形,F-actin荧光强度降低,细胞内微丝较细,双荧素酶报告系统的荧光值降低（P﹤0.01）;相比于中药组,中药实验组H9C2细胞面积增大,细胞形态不规则、粗大,细胞内F-actin荧光强度增强（P﹤0.01）,微丝增多增粗,双荧光系统荧光值明显升高（P﹤0.01）。结论:1.结扎LAD可见大鼠心电图ST段明显升高并有大面积心肌梗死,说明手术流程可靠;术后大鼠经力竭式游泳、饥饿造成慢性心衰模型,其体征符合临床表现,心脏重量增加,心功能（BNP、EF值）降低,心衰时RAAS系统主要指标Ang Ⅱ升高,贴近临床,是可靠的慢性心衰造模方法。2.补肾活血方可提高慢性心衰大鼠心功能（BNP、EF值）,改善心肌排列,改善心室结构（LVEDD、LVESD）,调节“心肾相关”因子Klotho、OPN的表达,明确“心肾相关”理论对于慢性心衰治疗的指导地位。3.补肾活血方可下调大鼠心肌组织中β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达,下调Myc m RNA表达,表明补肾活血方可调控Wnt/β-catenin信号通路中的多个信号分子靶点,并通过Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制心肌肥大作用。补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。4.实验显示,Ang Ⅱ可刺激H9C2细胞肥大,且其机制与激活Wnt/β-catenin信号通路有关,补肾活血方可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路达到抑制心肌肥大的作用,其作用靶点位于通路传导中β-catenin的上游,结合体内实验可推断补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。