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目的:研究Twist2在前列腺癌中的表达及其与肿瘤恶性程度间的内在联系。探索雄激素/AR与Twist2在雄激素依赖与雄激素非依赖前列腺癌细胞中的相互调控机制。揭示雄激素/AR-Twist2轴在前列腺癌恶性增殖、侵袭及EMT中的作用。材料与方法:收集上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科自2007年11月~2014年4月间前列腺癌根治术标本93例,另取正常前列腺组织14例。免疫组化法检测前列腺肿瘤组织与正常前列腺组织石蜡标本中Twist2的表达。在雄激素/AR与Twist2在前列腺癌中的相互调控作用研究中,先分别以0.1nmol/l、1nmol/l及10nmol/l浓度梯度的DHT处理LNCAP细胞系及PC-3细胞系,而后分别以RT-PCR及Western Blot分析Twist2的m RNA及蛋白表达情况。接着,使用比卡鲁胺预处理LNCAP及PC-3细胞系,功能性抑制雄激素/AR轴,而后加入1nmol/l DHT,以RT-PCR检测LNCAP及PC-3细胞系Twist 2的m RNA表达。进而以Western Blot测定LNCAP细胞系使用比卡鲁胺功能性抑制雄激素/AR轴后,0.1nmol/l、1nmol/l及10nmol/l浓度梯度DHT下Twist 2的蛋白表达。为明确Twist2对雄激素/AR轴的反向调控作用,构建Twist 2过表达及sh RNA-Twist2载体,转染LNCAP及PC-3细胞系。在LNCAP细胞系,以RT-PCR与Western Blot检测空白对照、0.1nmol/l、1nmol/l及10nmol/l浓度梯度DHT下Twist2过表达及下调细胞的AR及雄激素特异性调控产物PSA的表达量;在PC-3细胞,由于其AR表达极其微量,故以RT-PCR与Western Blot检测上述浓度梯度DHT下PSA的表达量。最后,利用荧光素酶报告基因检测法观察LNCAP细胞与PC-3细胞Twist2过表达及下调后对AR转录活性的影响。在研究雄激素/AR-Twist2轴对前列腺癌细胞增殖、侵袭与EMT的影响的部分中,以空白对照、0.1nmol/l、1nmol/l及10nmol/l浓度梯度DHT处理LNCAP及PC-3细胞,MTT法观察24Hr、48Hr及72Hr后细胞增殖情况。而后,以上述浓度梯度DHT处理Twist2过表达及下调的LNCAP及PC-3细胞,MTT法观察24Hr、48Hr及72Hr后细胞增殖情况。采用划痕试验及Transwell试验探索雄激素/AR-Twist2轴对前列腺癌细胞侵袭性的影响:以空白对照、0.1nmol/l、1nmol/l及10nmol/l浓度梯度DHT处理LNCAP及PC-3细胞72小时,观察细胞迁移及侵袭情况;而后,以上述浓度梯度DHT处理Twist2过表达及下调的LNCAP及PC-3细胞72小时,观察细胞迁移及侵袭情况。最后,以空白对照、0.1nmol/l、1nmol/l及10nmol/l浓度梯度DHT处理LNCAP及PC-3细胞,借助RT-PCR及Western Blot分析EMT标志物E-cadherin和Vimentin的m RNA和蛋白表达;继而对比Twist2过表达与下调后上述浓度梯度DHT下LNCAP及PC-3细胞EMT标志物的表达差异,明确雄激素/AR-Twist2轴对前列腺癌细胞EMT的影响。结果:在免疫组化研究中,107例研究对象中正常前列腺组织14例,前列腺癌Gleason≤6组织16例,Gleason 7组织60例,Gleason≥8组织17例。Twist2的表达主要位于前列腺上皮细胞胞浆;正常前列腺组织与前列腺癌组织的Twist2表达存在显著差异(P<0.05);Gleason≤6、Gleason 7及Gleason≥8前列腺肿瘤组织Twist2表达存在显著差异(P<0.001)。以DHT刺激雄激素/AR轴后,在LNCAP细胞与PC-3细胞中,1nmol/l及10nmol/l的DHT浓度下,Twist2 m RNA水平较0.1nmol/l刺激下显著增高(P<0.001);Western Blot灰度值分析提示两细胞系中Twist2蛋白表达水平均随DHT浓度增加呈显著上升的趋势。此外,无论是空白对照还是同浓度的DHT刺激下,PC-3细胞株的Twist2表达水平显著低于LNCAP细胞株。以比卡鲁胺功能性抑制雄激素/AR轴后,以1nmol/l DHT处理LNCAP与PC-3细胞系,结果显示LNCAP细胞DHT相关性Twist2增高被显著抑制(P<0.001),而在PC-3细胞中,比卡鲁胺的这种抑制作用并不明显。进一步Western blot检测证实,在LNCAP中,加入比卡鲁胺预处理后,在0.1nmol/l,1nmol/l及10nmol/l DHT浓度下,Twist2蛋白表达水平均较无比卡鲁胺预处理组显著下调。过表达和下调Twist2后,在LNCAP中,Twist2过表达组AR m RNA表达量显著高于Twist2下调组,且随着DHT浓度的升高,AR表达量进行性升高,而当Twist2被下调后,AR表达对DHT的刺激不再敏感,相应地,PSA的表达与AR呈同样的趋势。在PC-3细胞中,由于其AR表达量极低,故仅对PSA的m RNA变化进行分析。其PSA表达变化趋势与LNCAP细胞类似。此外,在LNCAP细胞,Twist2过表达组与Twist2下调组相比,AR转录活性显著增强(P<0.01),但在PC-3细胞,这种差异并不明显。在细胞增殖实验中,DHT对LNCAP细胞系的增殖有一定的促进作用。在给药72Hr后,各浓度的DHT对LNCAP细胞的增殖起稳定促进作用,与对照组相比呈显著差异(P<0.001)。在无DHT刺激的条件下,在各时间节点Twist2过表达细胞的增殖速率均显著大于Twist2下调细胞的增殖速率(P<0.001),且随着时间的推移,两者间的差距逐渐增加。对PC-3细胞系而言,DHT对细胞增殖促进作用不明显。但在无DHT刺激条件下,各时间节点Twist2过表达细胞的增殖速率均显著大于Twist2下调细胞的增殖速率(P<0.001),且随着时间的推移,两者间的差距有所增加。在划痕实验中,DHT对LNCAP及PC-3细胞的迁移均有显著促进作用。在LNCAP与PC-3细胞,划线72Hr后,Twist2过表达组迁移细胞数量较Twist2下调组均显著增加(P<0.001)。进一步评估细胞侵袭能力的Transwell实验显示,对于LNCAP与PC-3细胞,在同一时间节点,DHT给药组细胞侵袭数量较对照组显著增加(P<0.001)。无DHT刺激条件下,Twist2过表达后,LNCAP与PC-3细胞的侵袭性较正常细胞显著增强(P<0.001),而Twist2下调后,LNCAP与PC-3细胞的侵袭性较正常细胞明显减弱(P<0.001)。在LNCAP细胞中,随着DHT浓度的递增,Twist2的表达呈进行性升高(P<0.05);E-cadheirn的表达呈逐渐减低的趋势(P<0.05);Vimentin的表达亦随着DHT刺激浓度的增加进行性上升(P<0.01)。在PC-3细胞中,随着DHT浓度的递增,Twist2、E-cadheirn与Vimentin三者的蛋白表达变化趋势与LNCAP细胞系一致。无DHT刺激,Twist2过表达LNCAP与PC-3细胞的E-cadheirn表达显著低于Twist2表达下调细胞(P<0.001),而Vimentin表达显著高于Twist2表达下调细胞(P<0.001)。结论:Twist2在前列腺肿瘤组织中的表达显著高于正常前列腺组织,且表达强度随着肿瘤恶性程度的增加而增强。在雄激素依赖的LNCAP细胞,雄激素/AR轴对Twist2存在正向调控作用,而Twist2对AR的表达亦达存在正反馈作用,且Twist2直接调控AR基因的转录活性。在LNCAP细胞中,Twist2是重要的增殖调控因子并促进肿瘤细胞的迁移与恶性侵袭,而实现这一调控的重要途径即为雄激素/AR-Twist2轴。在雄激素非依赖的PC-3细胞,雄激素/AR轴与Twist2间的相互调控作用不明显,且由于雄激素受体的极低表达,雄激素/AR信号通路对PC-3细胞增殖的直接调控作用十分有限,但其对肿瘤细胞的迁移与侵袭仍有重要意义。尽管如此,Twist2仍是促进PC-3细胞增殖、迁移与侵袭的重要因子。另外,雄激素/AR-Twist2轴直接参与了前列腺癌EMT转化,Twist2是前列腺癌EMT过程中的关键因子。由此可见,Twist2在未来可能作为对前列腺癌进行深入分子分型的重要标志物之一,并成为最终实施精确治疗的潜在靶点。