第一部分PI3K/AKT与Nrf2在糖尿病大鼠肾组织中的表达及意义目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管并发症,并且也是终末期肾脏病最常见的病因。DN是以持续性和进行性蛋白尿并伴随肾小球滤过率下降,肾小球毛细血管和肾小管间质受损为主要特征。有研究证实在病变早期,足细胞损伤和丢失是导致蛋白尿的主要原因,而足细胞损伤主要来自高糖诱导发生的氧化应激。氧化应激反应中产生的过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)长期蓄积,并激活参与DN发展的相关信号传导途径,导致细胞凋亡、炎症反应、纤维化、衰老等事件发生。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)是细胞调控氧化应激的关键因子,是清除细胞内过量ROS以抗氧化应激最敏感的信号。它参与了细胞各种生命活动,包括维持氧化还原平衡、增殖、代谢及凋亡。有研究表明磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)信号通路可调节Nrf2的活性。AKT磷酸化进一步帮助Nrf2实现核浆穿梭,从而使细胞内源性抗氧化增强。本部分旨在研究糖尿病大鼠肾脏组织中p-AKT、Nrf2蛋白的表达变化,并定位足细胞。初步明确其特点、相互关系及对细胞凋亡、氧化应激的影响,为进一步糖尿病肾病靶点治疗提供分子机制理论基础。方法:健康雄性SD大鼠被随机分为两组,一组为正常对照组(normal control group,NC),另一组为糖尿病模型组(diabetic group,DM),每组12只。DM组大鼠按65 mg/kg体重给予腹腔单次注射1%STZ溶液,NC组大鼠给予相当体积的0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射72小时后,取尾静脉血检测血糖。将血糖≥16.7 mmol/L且尿糖阳性(+++～+++)即为糖尿病模型制备成功。两组动物分别于造模制备成功后12周末随机取6只采集标本。处死前予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏取血用于检测血糖、血尿素氮和血肌酐值。打开腹腔取双侧肾脏,切取部分肾组织用OTC包埋,该部分用于冰冻切片免疫荧光染色。部分肾组织放于4%多聚甲醛溶液固定,用于后续HE染色。部分肾皮质用于制备组织匀浆提取蛋白,western blot检测Nox4蛋白的表达。结果:1.相较正常对照组,12W糖尿病大鼠生化指标检测结果显示,血糖、血肌酐和尿素氮水平明显增高(P<0.01)。2.肾组织切片HE染色可见,正常对照组大鼠肾脏结构未见明显改变,糖尿病组可见肾小球体积增大,系膜基质增多,肾小球部分毛细血管管腔狭窄,间质增宽,炎性细胞浸润。3.肾脏组织冰冻切片免疫荧光双染色结果可见,选择足细胞标志蛋白Nephrin对足细胞进行标记,与正常对照组相比较,促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3在糖尿病大鼠肾脏足细胞内表达显著升高。Nrf2、p-AKT在糖尿病大鼠肾脏足细胞内表达显著下降。4.Western blot结果显示,与正常对照组相比较,12周糖尿病大鼠肾脏皮质Nox4蛋白表达水平显著升高(p<0.05)。应用Mito sox red荧光探针检测肾脏组织线粒体内ROS水平,结果显示12周大鼠肾皮质线粒体ROS较正常对照组明显升高。第二部分PI3K/AKT与Nrf2对高糖诱导的足细胞氧化应激和凋亡的影响及机制目的:糖尿病肾病发病机制非常复杂,至今未能明确阐明。近年来大量研究表明,糖尿病肾病中蛋白尿的产生与足细胞的功能和形态学改变密切相关。高血糖诱导足细胞损伤后发生一系列病理改变,主要包括足细胞肥大、足细胞凋亡、足细胞上皮间充质转分化和足细胞脱离。高糖诱导产生的ROS是足细胞损伤触发因素。线粒体是ROS的产生中心,ROS过量产生刺激促凋亡蛋白的转运及线粒体呼吸链细胞色素C的释放,触发诱导线粒体介导的细胞凋亡途径。在多种研究中已被证实,抑癌基因p53作为一种重要的促凋亡蛋白,参与了细胞凋亡的调控。p53能够触发促凋亡基因的表达,例如Puma、Bax、Apaf-l、Noxa。此外,它抑制抗凋亡基因的表达,如Bcl-2家族(Bcl-2,Bcl-X,Bcl-In,Mcl-1)的表达;在p53转录非依赖的细胞凋亡是通过线粒体介导实现的,研究发现在仅细胞浆成分(不含细胞核但包含线粒体)的细胞中,发现p53蛋白能直接介导影响Caspase-3的活化。后续实验中应用免疫沉淀方法去除p53蛋白后,Caspase-3活化被抑制。通过第一部分实验结果,我们推测p-AKT及Nrf2参与了糖尿病的发病及进展,也同时参与了足细胞抗氧化应激和抗凋亡的过程。在本部分实验中,应用体外培养小鼠足细胞进一步观察足细胞PI3K/AKT对Nrf2通路的影响,明确Nrf2是否对高糖环境下足细胞凋亡及p53转录非依赖性信号通路产生影响。方法:1.检测抑制PI3K/AKT对Nrf2通路表达的影响,将足细胞分为正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、正常糖+LY294002(20μM)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+LY294002(20μM)。LY294002预处理2小时,高糖刺激48小时。提取细胞总蛋白及总mRNA,通过 western blot 检测 AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO-1、SOD2、GCLC的蛋白表达。通过 qRT-PCR 检测 Nrf2、HO-1、NQO-1、SOD2、GCLC的mRNA表达。通过western blot检测Nrf2蛋白在细胞核中的表达。通过细胞免疫荧光检测Nrf2在足细胞中的分布情况。2.检测Nrf2-siRNA对Nrf2基因的敲低效果,将分化成熟的足细胞分为空载negtive control组(NC)和转染Nrf2-siRNA(siNrf2)分别培养,于48小时后收集细胞提取总蛋白,并通过western blot进行验证敲低效果。3.检测敲低Nrf2基因或抑制PI3k/AKT通路对高糖环境下足细胞氧化应激的影响。将分化成熟的足细胞分为正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+siNrf2、高糖+LY294002(20μM)。siNrf2进行转染,LY294002预处理2小时,各组均在高糖刺激48小时。应用荧光探针DCFH-DA染色对细胞内ROS进行检测,Mito sox red荧光探针染色检测线粒体内ROS水平,JC-1荧光探针染色明确线粒体膜电位情况。4.检测敲低Nrf2基因对高糖环境下足细胞凋亡的影响,将分化成熟的足细胞分为正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+阴性对照(negative control,NC)、高糖+siNrf2。转染成功后高糖刺激48小时。收集细胞提取总蛋白,通过western blot 检测 Bax、Bcl-2、Cytochrome c、Cleaved caspase-3 蛋白的表达。TUNEL染色检测阳性凋亡细胞。5.为了检测敲低Nrf2基因对高糖环境下p53转录非依赖性信号通路的影响,将实验细胞分为正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+阴性对照(negative control,NC)、高糖+siNrf2。siNrf2转染成功后,在高糖刺激48小时后收集细胞,分别提取总蛋白和细胞核蛋白,通过western blot检测p53的表达。通过Mito tracker red探针检测线粒体形态和细胞免疫荧光,定位p53在线粒体的分布。结果:1.高糖刺激下p-AKT和Nrf2及其下游蛋白表达明显降低。经过LY294002处理后,p-AKT和Nrf2及其下游蛋白表达降低更为显著,具有统计学意义。Nrf2及其下游基因mRNA表达也呈相同的变化趋势。此外,LY294002能够降低高糖刺激下细胞核内Nrf2的蛋白表达(P<0.05),与Nrf2细胞免疫荧光结果变化一致。2.荧光探针DCFH-DA及Mito sox red染色结果显示,HG组荧光强度明显比NG组增强。与HG组相比,在HG+siNrf2组及HG+LY294002组荧光强度明显增强。JC-1探针染色显示,相较NG组,HG组JC-1绿色荧光则明显增强,经siNrf2及LY294002处理后绿色荧光相较HG组显著增强,红色荧光显著减弱。3.与 HG 组相比,HG+siNrf2 组 Bax/Bcl-2 比值、Cytochrome c 以及Cleaved caspase-3的蛋白表达升高较显著。TUNEL细胞染色也同样提示敲低Nrf2后高糖导致的阳性凋亡细胞数显著升高。4.Western blot结果显示,HG组p53蛋白在细胞质及线粒体中的表达较NG组明显升高。与HG组相比,HG+siNrf2组p53蛋白在线粒体中的表达显著升高。p53细胞免疫荧光与western blot结果一致。Mito tracker red荧光探针染色显示HG组线粒体明显变短,呈现出肿胀、碎片化表现,在HG+siNrf2组较HG组碎片化更为明显。在HG+siNrf2组,p53绿色荧光与Mito tracker red探针呈现的红色荧光所重合成黄色荧光明显增多。第三部分肌肽通过PI3K/AKT与Nrf2通路对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和凋亡的影响目的:肌肽(Carnosine,CA)是一种内源性二肽,具有缓冲生理酸碱性、螯合金属离子和抗氧化应激、抑制多种炎症因子、抑制AGEs、促进脂质氧化终产物(advancing lipoxidation end products,ALEs)和抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)等生物活性。据报道,肌肽可以通过降低血清肌肽酶-1的活性,防止STZ糖尿病大鼠肾小球细胞凋亡和足细胞丢失。通过前两部分研究,PI3K/AKT通路可能是参与肌肽对高糖诱导细胞凋亡保护作用的潜在分子机制。因此,在本部分实验中。我们将就肌肽能否通过PI3K/AKT和Nrf2信号通路干预高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和细胞凋亡进行研究。方法:1.检测肌肽对高糖环境下足细胞活性及氧化应激的影响,将分化成熟的足细胞分为:正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+肌肽(5mM Carnosine,CA)、高糖+肌肽(10mM Carnosine,CA)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)、高糖+肌肽(30mM Carnosine,CA)。各组均在刺激48小时后应用Cell Counting Kit-8实验检测各组细胞活性,荧光探针DCHF-DA和Mito sox red检测各组细胞内和线粒体ROS水平。2.检测肌肽对高糖环境下足细胞凋亡的影响,将分化成熟的足细胞分为:正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+肌肽(5mMCarnosine,CA)、高糖+肌肽(10mM Carnosine,CA)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)。各组均在高糖刺激48小时后收集细胞,提取蛋白后通过western blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 和 Nephrin 蛋白的表达。TUNEL 染色检测各组凋亡细胞。3.检测肌肽对高糖环境下足细胞PI3K/AKT和Nrf2通路的影响。将分化成熟的足细胞分为:正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、肌肽(20mM Carnosine,CA)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)。各组均在高糖刺激48小时后收集细胞,提取细胞总蛋白,通过western blot检测细胞AKT、p-AKT、Nrf2和HO-1的蛋白表达水平。提取细胞核蛋白,检测Nrf2蛋白的表达。应用细胞免疫荧光检测Nrf2在细胞的分布。4.检测抑制PI3K/AKT对Nrf2通路表达及肌肽抑制足细胞凋亡的影响。将分化成熟的足细胞分为:正常糖组(5.5mM glucose,normal glucose,NG)、LY294002(20μM)、高糖组(30mM glucose,high glucose HG)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)+LY294002(20μM)。LY294002预处理细胞2小时,各组均在高糖刺激48小时后收集细胞,提取细胞总蛋白,通过western blot检测细胞AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2 和 Cleaved caspase-3 的蛋白表达水平。TUNEL染色检测各组凋亡细胞。通过qRT-PCR检测Nrf2、HO-1的mRNA表达。5.明确在高糖环境下,足细胞中敲低Nrf2基因或抑制PI3K/AKT通路对肌肽抑制氧化应激和细胞凋亡的影响。将分化成熟的足细胞分为:高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)+LY294002(20μM)、高糖+肌肽(20mM Carnosine,CA)+siNrf2。LY294002预处理细胞2小时,转染成功后,各组均在高糖刺激48小时后收集细胞。提取蛋白后,应用 western blot 检测细胞 Bax、Bcl-2 和 Cleaved caspase-3的蛋白表达水平。TUNEL染色检测各组凋亡细胞。荧光探针DCHF-DA和Mito sox red检测各组细胞内和线粒体ROS水平。结果:1.高糖环境下,在肌肽浓度为5-20mM范围内,细胞活性呈剂量依赖性上升,在浓度为30mM时呈下降趋势。肌肽(5-20mM)可以降低HG诱导足细胞内和线粒体产生的ROS。2.在肌肽浓度范围为5-20mM内,TUNEL染色显示高糖诱导的足细胞凋亡降低并呈剂量依赖。Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3表达均呈剂量依赖性降低,Nephrin蛋白的表达呈剂量依赖性升高。3.高糖环境下,Nrf2、HO-1和p-AKT蛋白的表达相较NG组显著降低,而在HG+CA(20mM)组,Nrf2、HO-1及p-AKT蛋白表达水平较HG组升高。细胞免疫荧光结果显示HG组Nrf2在细胞核的荧光强度显著减弱,在HG+CA(20mM)组显著增强。在HG+CA(20mM)组细胞核Nrf2蛋白的表达明显高于HG组。4.TUNEL染色结果显示LY294002预处理过的HG+CA(20mM)组,凋亡细胞高于 HG+CA(20mM)组。Bax/Bcl-2 比值和 Cleaved caspase-3的表达和TUNEL染色结果一致。经LY294002预处理过的肌肽和高糖共同孵育组相较于HG+CA(20mM)组,Nrf2和HO-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。qRT-PCR结果与蛋白表达变化保持一致。5.经siNrf2和LY294002处理后的肌肽和高糖共同孵育组细胞内和线粒体内ROS荧光、凋亡细胞明显增加,Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3蛋白表达均明显升高。结论:1.p-AKT、Nrf2在糖尿病大鼠肾足细胞和高糖环境下小鼠足细胞中的表达均降低,且伴随细胞凋亡和氧化应激增加,PI3K/AKT与Nrf2通路可能共同参与了糖尿病肾病中足细胞损伤的发生。2.PI3K/AKT通路可以通过介导Nrf2活化和核转位及下游蛋白HO-1、NQO-1、SOD2和GCLC的表达来抵抗糖尿病肾病中氧化应激的进展3.在高糖环境下足细胞存在线粒体损伤,Nrf2蛋白表达和活性降低以及p53水平增加可能是足细胞线粒体损伤的机制,敲低Nrf2基因后,p53转位线粒体增加,通过线粒体介导的凋亡途径启动细胞凋亡。4.肌肽可以抑制高糖刺激下足细胞的氧化应激和细胞凋亡。