猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪流行性腹泻(PED)的病原,也是猪重要的肠道病原之一；本病以引起猪的急性水样腹泻、呕吐和迅速脱水为主要特征,5日龄内的仔猪感染后死亡率可达100%。因此,我国大部分猪场都会用疫苗来预防PED。但是,从2010年以来,PED突然在我国南方地区暴发并迅速传播到全国各地,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失,而疫苗在这次的PED流行中并没有给猪群应有的保护。为了揭示猪场PED弱毒疫苗免疫失败的原因,本试验从广东、广西和湖北的3个规模化猪场得到了3株PED弱毒活疫苗,首先对3株疫苗毒株进行M基因的测序,结果显示3株疫苗毒株有两个疫苗毒株的序列完全一样,另一个毒株有1个核苷酸的突变,说明3株疫苗毒株来源相同。我们选取其中一株疫苗毒株,进行基因组全序列测定,并分析疫苗毒株与流行毒株的全序列、S、M、 N、ORF3的核苷酸和氨基酸的序列差异,从基因水平上分析猪场免疫失败的原因。遗传进化结果显示,无论在全基因组水平还是在各个基因水平,疫苗毒株与目前流行毒株的亲缘关系都很远。在全基因组水平,疫苗毒株与目前流行毒株的同源性为97.1%-97.2%；在三个结构基因S、M、N的水平上疫苗毒株与目前流行毒株的核苷酸(氨基酸)同源性分别为93.7%-95%(92%-93.4%)、97%-98.7%(97.3%-98.6%)、95.7%-97.3%(95.9%-97.5%)。由此可以看出疫苗毒株与流行毒株的核苷酸同源性很低,从一个方面说明弱毒疫苗不能很好的保护仔猪免受流行毒株的感染。分析疫苗毒株和流行毒株的主要免疫原性基因发现,在S基因预测的受体结合位点和诱导机体产生中和抗体的关键区域,疫苗毒株和流行毒株都有氨基酸的突变,在M基因和N基因内部,流行毒株相对于疫苗毒株也有很多氨基酸位点的突变,预测这些位点的突变可能造成了流行毒株毒力的增强或者造成PEDV抗原性发生变化,从而造成了PEDV弱毒疫苗对PED流行毒株免疫失败。通过PEDVM基因和N基因的进化树、核苷酸和氨基酸的序列比较发现,以中国2004年的毒株JS-2004-2为代表的PEDV毒株与近两年流行的PEDV变异毒株在进化关系和同源性方面都很接近,说明他们之间的亲缘关系很近,由此可以推测PEDV的变异毒株可能很早就在我国的猪场存在。我国目前的流行的PED变异毒株很有可能就是由这些毒株进化来的。推测在2010年之前,这些毒株可能只是在很小的区域存在,加上PEDV引起的临床症状和病理变化与TGEV很相似,这些变异毒株被忽略了,随着地区间猪场的交流增多,变异毒株在全国传播,才造成2010年以来的PED在我国暴发。感染性克隆是研究RNA病毒致病机理的理想工具,用于感染性克隆的病毒,最好是适应细胞的病毒。本实验以PEDV弱毒疫苗毒株为基础,构建了覆盖PEDV基因组全长的重组质粒,以及用于体内转录的5’端(含CMV启动子)和3’端(含polyA+HDV核酶+BGH+polyadenylation序列)以及体外转录所需要的5’端(含T7启动子)和3’端(含polyA),为PEDV感染性克隆的构建打下基础,并且在构建重组质粒的过程中引入突变位点,以区分转录获得的病毒和亲本毒株,在构建重组质粒的过程中还突变了一个基因组内部的Not I限制性酶切位点,从而保证获得的全长cDNA,可以插入到BAC载体中。