肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝脏在受到诸如病毒、毒物、药物、酒精以及免疫等内外因素的持续刺激时引起的以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为主要特征的慢性肝脏疾病,细胞外基质的过度沉积是肝纤维化发生的基础,而肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)的激活是发生肝纤维化的中心环节。在正常情况下的HSCs处于静止状态,当肝脏受到各种致病因子刺激时,HSCs被激活转化为肌成纤维样细胞,激活后的HSCs发生一系列的变化,如大脂滴消失,细胞增殖加快,胶原开始大量沉积。与此同时,HSCs的激活伴随着“自噬潮”的发生,自噬抑制剂会在一定程度上阻止HSCs向肌成纤维样细胞的转化。自噬(autophagy)是一种细胞自我吞噬的现象,当细胞处于饥饿或应激状态下,细胞内一些功能失调或者生产过剩的细胞器会被包裹形成自噬体,这些自噬体与溶酶体融合而发生降解,降解的产物经再利用释放ATP,为细胞应对外界压力提供足够的能量。microRNA是一种小分子单链非编码RNA,它通过碱基互补配对与靶基因m RNA 3′非编码区(UTR)结合,抑制m RNA翻译,从而实现在转录后水平调控基因表达的效果。目前已发现成熟的mi RNA有35828种,调控着人类大约1/3的基因表达。mi RNA-30生物学作用十分广泛,目前诸多研究证明mi RNA-30参与调控细胞增殖、分化和免疫;参与机体生长、衰老等过程的调控,并在疾病尤其在肿瘤的发生与发展过程中发挥着重要作用。mi RNA-30a-5p是mi RNA-30的家族成员之一,现已证实在某些肿瘤细胞中它的靶基因之一是自噬相关蛋白Beclin-1,mi RNA-30a-5p通过抑制Beclin-1的表达实现对自噬的抑制作用。miRNA在诸多生理、病理过程中发挥着重要作用,但它与HSCs激活方面的研究甚少。对于mi RNA是否可作为治疗肝纤维化的潜在方法,本实验建立了mi RNA-30a-5p过表达和敲低的模型。目的:研究mi RNA-30a-5p的表达对HSCs激活的影响,并对其机制进行初步探讨方法:本实验通过体外培养HSCs,应用细胞转染技术转染mi RNA-30a-5p激动剂(mi RNA-30a-5p mimic)和mi RNA-30a-5p抑制剂(mi RNA-30a-5p inhibitor),在细胞水平探讨mi RNA-30a-5p对HSCs自噬和激活的影响。应用人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)作为自噬诱导剂,3-甲基腺嘌呤(3-MA)作为自噬的抑制剂,在mi R-30a-5p作用下通过调节自噬来观察mi RNA-30a-5p对HSCs激活的影响。通过real-time PCR(RT-PCR)技术检测m RNA的表达;Western blot技术检测细胞中蛋白的变化;用吖啶橙染色法观察自噬酸性小体的形成;细胞免疫荧光化学染色法检测自噬发生时自噬标志性蛋白LC3的改变。结果:1应用western blot技术检测PDGF干预终浓度分别为0 ng/ml组、10ng/ml组、20 ng/ml组、40 ng/ml组中细胞蛋白的表达情况。统计蛋白灰度值分析α-SMA在4组中的表达分别为0.86±0.02、0.95±0.04、1.5±0.14和1.00±0.09;Collagen-I在4组中的表达分别为0.39±0.02、0.41±0.02、0.51±0.02和0.42±0.02;Beclin-1在4组中的表达分别为0.14±0.02、0.17±0.02、0.40±0.03和0.24±0.01;LC3BII与LC3BI蛋白比值在4组中的情况3.22±0.38、3.88±0.30、8.65±0.31和4.41±0.43。在PDGF终浓度为20 ng/ml时对HSCs自噬和激活的作用最明显(P<0.05),因此,选择20ng/ml作为本实验PDGF干预浓度。2应用western blot技术检测PDGF 12小时干预组、24小时干预组和48小时干预组蛋白的表达情况。统计蛋白灰度比值分析α-SMA在3组中表达分别为0.70±0.03、0.35±0.03和0.25±0.02;Beclin-1在3组中的表达分别为1.35±0.21、0.62±0.04和0.30±0.02。在PDGF干预12小时时对HSCs自噬和激活的作用最明显(P<0.05),因此,选择12小时做为本实验PDGF的干预时间。3应用RT-PCR检测mi RNA-30a-5p的表达情况,结果表明HSCs中mi RNA-30a-5p在PDGF干预组的表达较对照组显著降低(0.34±0.02 vs.1.00±0.00)(P<0.05)。4应用RT-PCR检测在HSCs中转染不同终浓度(对照组、30 nmol/L组、50 nmol/L组和100 nmol/L组)的mi RNA-30a-5p mimic后的转染效率,分别为1.00±0.00、3.12±0.08、3.40±0.16和6.67±0.25,结果显示在mi RNA-30a-5p mimic终浓度为100 nmol/L组转染效率最高(P<0.01),因此,选择100 nmol/L作为本实验mi RNA-30a-5p mimic的处理浓度。5应用western blot技术检测HSCs中mi RNA-30a-5p对照组、mi RNA-30a-5p mimic组、mi RNA-30a-5p对照+PDGF组、mi RNA-30a-5p mimic+PDGF组细胞中蛋白的表达情况。结果显示在mi RNA-30a-5p组Collagen-I、Beclin-1、LC3BII/LC3BI的表达均较对照组显著降低(1.39±0.20vs.2.89±0.08,10.13±0.56 vs.13.19±0.44,0.15±0.04 vs.0.80±0.08)(P<0.05),P62表达较对照组表达升高(1.21±0.13 vs.0.97±0.01)(P<0.05),对HSCs进行PDGF处理后效果更明显。应用RT-PCR方法检测α-SMA、PDGFR-β、DDR2其结果与western blot结果一致。6应用RT-PCR检测在HSCs中转染不同终浓度(inhibitor对照组、20 nmol/L组、50 nmol/L组和100 nmol/L组)的mi RNA-30a-5p inhibitor后的转染效率,分别为1.00±0.00、0.13±0.03、0.08±0.01和0.21±0.02,结果显示在mi RNA-30a-5p inhibitor终浓度为50 nmol/L组转染效率最高(P<0.01),因此,选择50 nmol/L作为本实验mi RNA-30a-5p inhibitor的处理浓度。7应用western blot技术检测mi RNA-30a-5p inhibitor对照组、mi RNA-30a-5p inhibitor组细胞中蛋白的表达情况。统计蛋白灰度比值,结果显示在转染mi RNA-30a-5p inhibitor组中α-SMA、Collagen-I、Beclin-1的表达水平较对照组明显升高(0.07±0.01 vs.0.03±0.01,0.15±0.06 vs.0.08±0.02,0.13±0.03 vs.0.07±0.01)(P<0.01)。8应用吖啶橙染色方法检测观察mi RNA-30a-5p mimic对照组、mi RNA-30a-5p mimic组、mi RNA-30a-5p mimic对照+PDGF组、mi RNA-30a-5p mimic+PDGF组;mi RNA-30a-5p inhibitor对照组、mi RNA-30a-5p inhibitor组中酸性自噬囊泡的变化。结果显示mi RNA-30a-5p mimic组的红色荧光较mi RNA-30a-5p mimic对照组弱,在PDGF处理组对比更加显著。mi RNA-30a-5p inhibitor组的红色荧光较mi RNA-30a-5p inhibitor对照组明显增强。9应用荧光免疫细胞化学染色检测自噬标志蛋白LC3的表达情况。结果显示mi RNA-30a-5p mimic组LC3绿色荧光斑点较对照组表达量少且弥散性分布于胞浆内。10应用western blot技术分别检测对照组、3-MA组中Collagen-I、Beclin-1的表达。结果显示在3-MA干预组中Collagen-I、Beclin-1的表达较对照组均降低(0.05±0.01 vs 0.09±0.01,0.09±0.01 vs.0.19±0.03)(P<0.05)。11应用western blot技术分别检测mi RNA-30a-5p inhibitor对照组、mi RNA-30a-5p inhibitor组、mi RNA-30a-5p inhibitor对照+3-MA组、mi RNA-30a-5p inhibitor+3MA组蛋白表达,统计蛋白灰度比值,结果显示mi RNA-30a-5p inhibitor组中α-SMA和LC3BII/LC3BI蛋白比值明显高于对照组水平(3.05±0.17 vs.1.93±0.08,0.06±0.00 vs.0.04±0.00)(P<0.05);P62的表达水平低于对照组(1.40±0.49 vs.3.20±0.30)(P<0.01)。而应用3-MA干预后上述蛋白变化无显著差异(1.95±0.13 vs.1.89±0.15,0.04±0.00vs.0.04±0.00,0.95±0.12 vs.1.11±0.12)(NS>0.05)。12应用生物信息学软件mi Randa,Target Scan,Pic Tar查找mi RNA-30a-5p与自噬相关的潜在靶点,筛选后取交集,确定Beclin-1为mi RNA-30a-5p的作用靶点。结论:mi RNA-30a-5p可以特异性的作用于自噬相关蛋白Beclin-1,通过减弱自噬的发生,从而抑制HSCs的激活。