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背景：随着肿瘤的相关机制研究及治疗技术的不断发展,我们对于肿瘤的发生发展有了更深入的了解。肿瘤细胞侵犯正常机体的一个重要特性即是其转移性。尽管我们对于这个复杂的过程的理解不断深入,但癌症转移仍然是癌症患者治疗失败的主要原因,。因此,探索和描述参与包括细胞迁移和侵袭在内的转移初始步骤的相关基因,可能提供给我们控制癌症转移的新目标。MicroRNAs (miRNAs)是高度保守的非编码,小分子RNA,它们被报道能通过转录后抑制,信使RNA降解,或者启动子的激活来调控转移相关基因,从而参与调控转移过程,发挥正向或负向的作用。miR-744最近被确定为一个新的肿瘤相关基因,在头颈部肿瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、乳腺癌患者的血清标本中均发现其表达水平的异常。我们以前也报道过,miR-744在人的鼻咽癌组织标本中的表达上调,以及miR-744的上调与鼻咽癌的进展显著相关。此外,我们首次证实了miR-744是一个参与癌症转移的复杂过程过程的原癌基因。然而,miR744在肿瘤中表达调控失调的机制从未被报道。只有Sanchez-Jimenez C等人发现,在HeLa细胞系(子宫颈癌细胞)中,miR-744的表达增加与作为细胞内稳态监管者的t细胞胞内抗原(TIA)的瞬时消耗有关。调控microRNA表达有几种机制,如基因结构的改变,,microRNA生物起源机制的缺陷,表观遗传的变化等等。转录因子活性的改变也是microRNA表达失调的一个重要调节机制。例如,肌原性的转录因子MyoD可以直接结合miR-182的启动子区域,从而促进miR-182表达,导致肿瘤进展。肿瘤蛋白MYC既能够正向调节癌基因miR-17-92家族的转录,也可以直接抑制抑癌基因let-7与miR-29家族的转录。目的：通过生物信息学预测技术,筛选出与miR-744上游启动子区域存在结合位点的转录因子,利用qPCR技术验证转录因子与miR-744表达的相关性,再运用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术确定转录因子与miR-744的直接结合位点,并用双荧光素酶报告实验进行进一步验证。最后,再在鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549中探索二者在肿瘤细胞的迁移与侵袭方面的共同作用机制。从而确定调控促癌基因miR-744表达的转录因子及其作用机制。方法：通过生物信息学预测软件PROMO2.0,预测出与miR-744上游启动子区域2kb内可能存在结合位点的转录因子。接着,根据预测结果,我们构建了转录因子的过表达质粒及小干扰RNA,选择鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549进行瞬时转染,培养48小时后使用TRIZOL方法提取细胞中的RNA,用poliA加尾法逆转录成cDNA后进行qPCR,检测细胞株中miR-744的表达情况,与空白对照组进行比较,从而探索转录因子与miR-744表达的相关性。接着,我们运用染色质免疫共沉淀技术(CHIP),特异性的研究转录因子与miR-744启动子区域的直接结合位点。我们选择了肺癌细胞株A549来进行染色质免疫共沉淀实验,用转录因子的过表达质粒转染后培养48小时,再依次进行细胞的甲醛交联和超声破碎,除杂与抗体孵育,超声破碎效果的检验,免疫复合物的沉淀以及清洗,DNA样品的回收,最后使用设计的针对结合位点的特异性引物进行qPCR扩增,分析。从而发现转录因子与miR-744启动子区的直接结合位点。然后,我们进行了双荧光素酶报告实验,进一步验证转录因子与miR-744启动子区域的结合。首先,我们用片段裁切法将miR-744的启动子区2kb长度的序列裁切成-2OOObp～-1 bp,-1000bp～-1 bp,-500bp～-1bp的三段序列并构建他们的萤火虫荧光质粒,与海肾荧光素酶质粒共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,培养48小时后检测荧光素酶活性并进行分析,从而确定miR-744的核心启动子区域,再挑选位于核心启动子区域中的结合位点进行下一步研究。我们将核心启动子区域的荧光素酶质粒与转录因子的过表达质粒共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,培养48小时,检测荧光素酶活性,通过与单独转染核心启动子区域的荧光素酶质粒的细胞株的荧光比较,进一步验证了转录因子可以通过作用于miR-744的核心启动子区域来调控miR-744的转录。接下来,我们构建了特异性突变转录因子与miR-744结合位点突变的核心启动子区域的突变型荧光素酶质粒,将其与转录因子过表达质粒共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,通过比较miR-744核心启动子区域野生型和转录因子过表达质粒共转染的细胞株的荧光活性,最终确定了转录因子对miR-744表达的调控是通过直接结合位于miR-744核心启动子区域的结合位点来发挥作用的。最后,我们进行了细胞功能实验,通过划痕实验和TRANSWELL实验来验证miR-744是否介导了c-Jun的促肿瘤细胞迁移与侵袭过程。将转录因子过表达质粒与miR-744的抑制剂anti-miR-744共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,用20uL的枪头划痕,孵育36小时后在倒置显微镜下拍照,比较它们的划痕愈合程度,从而比较鼻咽癌和非小细胞肺癌细胞株在迁移性上与单独转染转录因子过表达质粒的细胞株的差异,再进行transwell实验,transwell小室分为铺基质胶与不铺基质胶两种,每个小室内种入一定量的细胞,孵育24小时后用甲醛固定,苏木素染色在倒置显微镜下拍照,随机选取几个视野统计穿膜细胞的数目,取平均值计算出鼻咽癌和非小细胞肺癌细胞株的穿膜细胞数,从而发现它们在迁移性与侵袭性上与单独转染转录因子过表达质粒的细胞株的差异,从而得出miR-744介导了c-Jun促肿瘤细胞迁移侵袭功能的结论。结果：我们使用PROMO2.0软件,将miR-744启动子区域上游2kb的片段输入软件进行筛选。生物信息学预测显示,转录因子c-Jun与miR-744的上游启动子区域2kb长度内存在6个可能的结合位点,分别是：-1482 to-1488 bp,-1311to -1317 bp,-890 to -896 bp,一1261 to -1267 bp,-1582 to-1588 bp and-343 to-349bp,。转染c-Jun过表达质粒后,运用qPCR技术检测miR-744表达,发现鼻咽癌细胞株5-8 F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1,A549中miR-744表达较空白对照组明显上调,而转染c-Jun干扰RNA的细胞株的miR-744的表达较空白对照组明显下调,这些结果表明c-Jun能够调控miR-744的表达,并且极有可能是通过与miR-744的启动子区域结合来调控miR-744的转录。在染色质免疫共沉淀实验CHIP中,我们设计了4种引物,分别针对-1482～-1488 bp与-1582～-1588 bp,-1311～-1317 bp与-1261～-1267 bp,-890～-896 bp,-343～-349 bp进行特异性扩增,qPCR结果显示,c-Jun在miR.744启动子区域的-1482～-1488 bp与-1582～-1588 bp,-1311-1317 bp与-1261～-1267 bp,-890--896bp,-343～-349bp上均可直接结合。说明c-Jun对miR-744转录的调控是通过直接结合到miR-744启动子区域的结合位点而发挥作用的,而双荧光素酶报告实验发现miR-744的核心启动子区域为-500bp～-1bp,-343 to -349 bp位于这个区域内,因此预示着c-Jun对miR-744的转录调控最有可能是通过直接结合在-343～-349 bp。进一步的双荧光素酶实验证实了这一点。通过使用c-Jun过表达质粒转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1,A549后,miR-744的-500bp~-1bp片段的荧光活性较单独转染-500bp～-1bp的细胞株显著上升,从而说明c-Jun可通过作用于miR-744核心启动子区域-500bp～-1bp来影响miR-744转录。同时,共转染c-Jun过表达质粒与miR-744核心启动子区域野生型的鼻咽癌细胞株5-8F,HONE 1和肺癌细胞株SPC-A-11,A549中,荧光活性较共转染特异性突变转录因子与miR-744结合位点突变的核心启动子区域的突变型荧光素酶质粒的细胞株有显著上升,从而证实了c-Jun可通过直接结合于miR-744启动子区域的-343 to-349 bp,调控miR-744的转录。在细胞功能实验中,我们进行了细胞划痕实验与TRNSWELL实验来探讨迁移与侵袭。转染了c-Jun过表达质粒的鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1,A549株孵育36小时后,划痕愈合程度较空白对照组显著加快,而共转染c-Jun过表达质粒和miR-744抑制剂anti-miR-744的细胞株的划痕愈合程度较空白对照组则无明显变化。在transwell实验中,有基质胶与无基质胶的情况下,转染了c-Jun过表达质粒的鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1口肺癌细胞株SPC-A-1, A549株的穿膜细胞数目较空白对照组均有显著增加,而共转染c-Jun过表达质粒和miR-744抑制剂anti-miR-744的细胞株的穿膜细胞数目较空白对照组则无明显变化。这些结果表明miR-744介导了转录因子c-Jun促肿瘤细胞迁移侵袭功能结论：在这项研究中,我们发现1.miR-744的转录可被c-Jun上调2.c-Jun通过直接结合到miR-744的启动子区调控miR-744的转录3.miR-744介导了c-Jun的促肿瘤细胞迁移侵袭功能。3.我们的数据首次证明了c-Jun作用于原癌基因miR-744的转录调控机制,并且揭示了miR-744在肿瘤中表达上调的潜在机制,为进一步研究miR-744提供了方向。