濒危植物三尖杉分子标记及其遗传多样性分析

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本研究应用RAPD-PCR分子标记手段,研究了来源于福建省三尖杉几个主要天然分布区15个三尖杉样本的遗传多样性差异,同时从双酯碱含量差异方面研究了三尖杉天然群体间双酯碱含量变异规律以及从种子形态性状方面揭示了三尖杉种子的变异规律,通过比较三方面的研究结果来揭示福建省三尖杉的遗传多样性。三尖杉样品分别来自明溪,漳平的马山和天台山,柘荣的英山和富溪,以及永泰的嵩口和伏口。试验筛选了CTAB提取缓冲液,优化了提取步骤、提出了样品采集的最佳季节和采集的最佳部位,优化了PCR技术体系,筛选出能扩增多态性片段较多且扩增稳定的10条RAPD随机引物,分别对15个三尖杉个体的基因组DNA进行扩增,对三尖杉的遗传多样性和遗传结构进行了分析。主要研究结果如下:1、针对三尖杉中含有大量的色素、酚类化合物和多糖而导致DNA提取和纯化非常困难的现实,通过本论文研究比较,最终确定选用Ⅶ号提取液(100mmol/LTris-Hcl PH 8.0,0.14mol/LNacl,2%CTAB,20mmol/LEDTA-Na,2%β—巯基乙醇),经过提取步骤的优化,比较不同材料提取效果后总结出5、7、9月的三尖杉幼叶是三尖杉基因组DNA提取的最好材料。2、通过研究,建立了三尖杉RAPD分析的技术体系。反应终体积是25μl,1×Buffer2.5μl、Mg2+ 2.5mM、dNTPs0.2mM、引物0.6μM、Taq酶1.5U、模板DNA50ng、灭菌ddH2O 13.9μl。PCR循环程序如下:94℃预变性5min:94℃变性45s,38℃退火1min,72℃延伸1min,45个循环;最后72℃延伸10min:4℃结束扩增。3、从5个系列100条引物中,筛选出能够扩增出稳定产物、扩增谱带清晰、特异性强的10条引物供三尖杉遗传多样性分析选用。利用筛选出的10个引物和优化的RAPD反应程序和反应体系,对来自福建省内6个不同三尖杉居群15个个体进行全面的RAPD分析并得到多态性,结果在全部供试资源中共扩增出91条重复性好、清晰的位点,其中多态位点共计67个,占73.6%平均每个引物可获得9.2个位点。4、聚类结果表明:当遗传距离为0.320时15个不同来源的三尖杉优树个体被划分为四组。第一组为来自漳平马山和天台山森林公园的MS-1、MS-2、MS-3、TTS-4、TTS-5、TTS-6,第二组有来自明溪的MX-1、MX-2,柘荣英山和富溪的ZL-1、ZL-2被列入第三组,第四组包括SK-1、SK-2、SK-3、FK-4、FK-5。当遗传距离为0.5340时又被分为两类,第一类包括第一组、第二组,第二类包括第三组和第四组。从地理位置来看,第一类处于闽西,闽西北,第二类处在福建省的东部或东南部。说明福建省三尖杉优树个体种群划分在DNA分子水平上只能相略地划分为东部和西部两个种群。但种群位置和地理位置是否真正具有相关性,还有待将样品材料增加,材料来源更为丰富后,作进一步的研究。5、不同群体间双酯碱含量存在着极显著性的差异,其中祏荣富溪群体含量最高为170.3μg/g,漳平天台山群体的含量最低为131.4μg/g,双酯碱含量变异幅度为1.3倍。6个群体双酯碱含量由高到低依次是:柘荣富溪>柘荣英山>永泰紫山>永泰黄溪>漳平马山>漳平天台山。对各群体双酯碱含量系统聚类进行分析在相似系数为0.70时可将6个群体分为3组,基本上是地理距离相近的聚为一组。这与分子标记手段得出结果类似。6、从相关系数来看,在发芽率与各性状的相关性方面三尖杉种子长、宽、厚、长宽比、重、大小、比重等形态特征与种子发芽率有一定的正相关,特别是种子的单粒重、大小和比重与发芽率的相关,其相关系数都达到了显著或极显著水平,而长厚比和宽厚比与发芽率却成负相关其中宽厚比与发芽率还成极显著的负相关。聚类结果表明来源于永泰黄溪和柘荣的三尖杉种子形态差异上比较不明显;来源于漳平的三尖杉种子与其它居群有明显的差异,这与分子标记方法聚类结果相似。
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