实验目的香菇多糖（Lentinan,Lent）是一种有效的免疫调节剂,它能广泛地提高机体免疫防御的能力,增强宿主对病毒、细菌、真菌以及寄生虫等的抗感染能力,同时还具有抗肿瘤作用。目前研究表明,香菇多糖激发的抗感染免疫保护性机制依赖于辅助宿主诱导固有免疫和适应性免疫应答,它能显著活化巨噬细胞,促进一氧化氮（NO）生成和淋巴细胞的增殖,诱导干扰素或白细胞介素等细胞因子的产生,因此香菇多糖被称为“巨噬细胞参与的T细胞免疫增强剂”。疟疾是疟原虫通过蚊传播的严重的寄生原虫感染性疾病。《Nature》公布的统计数据显示,世界上100多个国家为疟疾流行区,约22亿人口受到疟疾的威胁,每年有300-500万疟疾临床病例,病人死亡人数高达110-270万。然而,由于疟原虫对氯喹等抗疟药产生抗药性,疟防措施已面临着严重的挑战,迫切需要研制新的疟疾疫苗和疟疾防治方法以控制这种传染病的流行。不断积累的研究数据表明,以IFN-γ显著升高为特征的Th1免疫应答的有效建立是保护性免疫效应发挥的关键因素。同种或异种疟原虫感染不同遗传背景小鼠,其产生的免疫应答具有明显的差异性。在致死性鼠疟感染时Th1免疫应答无法有效建立与红内期CD4⁺CD25⁺调节性细胞（Tregs）的过早活化有关。Tregs作为一组具有免疫调控作用的重要细胞群,以细胞间直接接触和分泌IL-10或TGF-β等细胞因子等方式发挥抑制性免疫调节效应。最近一项研究指出疟疾感染早期变异疟原虫与DCs通过TLR9依赖途径激活Tregs,而且通过分泌IL-10和诱导CD4⁺T凋亡实现免疫逃避。为了研究香菇多糖对致死性鼠疟感染红内期免疫应答的调节效应及其相关机制,本实验用香菇多糖预处理致死型约氏疟原虫（Plasmodium yoelii 17XL,Py17XL）感染BALB/c小鼠,动态观察感染早期感染BALB/c小鼠Th1免疫应答的差异:Tregs细胞数量的变化和功能特点;脾树突细胞表面分子的表达和分泌细胞因子的情况,以期阐明香菇多糖对致死性鼠疟感染红内期免疫应答的调节效应及其相关机制,从而为疟疾疫苗的研制和防治提供理论依据。实验方法1、实验动物及其模型构建6～8周龄、雌性BALB/c小鼠,经腹腔接种1×10⁶Py17XL寄生的红细胞,构建实验动物模型。2、采用双抗体夹心ELISA法及Griess反应检测Py17XL感染的BALB/c小鼠脾细胞培养上清IL-12、IFN-γ、NO2。的含量常规无菌摘取感染1d、3d和5d的BALB/c小鼠脾脏,用10ml含5%热灭活FCS的RPMI1640培养液制成细胞悬液,350×g,室温离心10min。经0.17mol/LNH₄CL裂解红细胞、RPMI1640洗涤2次,以台盼蓝液检查脾细胞活性,确定活细胞超过90%。用含10%FCS的RPMI1640调整脾细胞终浓度至1×10⁷/ml,24孔培养板（FALCON）,每孔加入500μl细胞悬液,一式3孔,培养48h。350×g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待细胞因子测定。双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清IL-12、IFN-γ含量分别进行检测,酶标仪（InterMedNJ-2100）测定450nm处OD值。绘制标准曲线,计算细胞因子含量（pg/ml）。Griess试剂检测脾细胞培养上清中NO₂^-含量,100μl细胞培养上清液和100μl Griess反应液室温反应10min,酶标仪检测550nm处OD值,以NaNO₂作为标准品进行浓度换算。3、采用流式细胞分析技术检测Py17XL感染的BALB/c小鼠脾Tregs及CD4⁺T细胞凋亡百分比无菌取出感染早期小鼠脾脏,制成1×10⁷/ml脾细胞悬液。每份样品用抗CD4-FITC单抗和抗CD25-PE单抗进行双色分析,另设阴性对照管。流式细胞仪专用染色管预先加人FcγⅢ/Ⅱ受体抗体2μl,取新鲜制备的1×10⁷/ml脾细胞悬液0.1ml,再加人抗CD4-FITC单抗、抗CD25-PE单抗各0.2μg。振荡器低速混匀,冰浴放置,避光反应30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,水平转头离心机300g,离心5min,弃上清,洗涤两次。每管加入500μ12%多聚甲醛固定液重悬,静置15 min上机。取binding buffer制备的1×10⁷/ml脾细胞悬液0.1ml,加人流式细胞仪专用染色管中,每份样品设阻性对照管,另一管分别加入AnnexinV-FITC和7-ADD（1μg/2.5×10⁵个细胞）各5μl。室温避光15min,每管加binding buffer 400μl,1h内上机。利用流式细胞仪（FACSCalibur,美国B&D公司）,激发波长为488nm,利用FACS CELLQUEST软件获取细胞,每个样品分析20,000个细胞,使用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）确定淋巴细胞群,以阴性对照为参考,将对照管所示的非特异荧光的99%以上作为本底扣除,以二维点阵图显示,记录Tregs及CD4⁺T凋亡细胞的百分比。4、采用双抗体夹心ELISA法检测Py17XL感染的BALB/c小鼠脾细胞培养上清抑制性细胞因子IL-10的含量常规无菌摘取感染早期的BALB/c小鼠脾脏,制成1×10⁷/ml脾细胞悬液,于24孔培养板（FALCON）中加入500μl细胞悬液,500μl/孔,一式3孔,于37℃培养48h。350×g室温离心10min,收集上清。用双抗体夹心ELISA法对IL-10含量进行检测,酶标仪（InterMedNJ-2100）测定450nm处OD值。应用SoftMax Pro4.3.1LS软件分析,绘制标准曲线,计算细胞因子含量（pg/ml）。5、流式细胞分析技术检测CD11c⁺DCs表面MHC-Ⅱ分子、协同共刺激分子（CD80、CD86）和TLRs（TLR-2、TLR4）的表达情况;双抗体夹心ELISA法检测CD11c⁺DCs分泌的IL-12的含量小鼠无菌摘取脾脏,用10ml含5%热灭活FCS的RPMI1640培养液制成细胞悬液,350×g,室温离心10min。经0.17mol/L NH4CL裂解红细胞、RPMI1640洗涤2次,用完全RPMI1640培养液（含10%热灭活的胎牛血清,1%L-谷氨酸盐,25μg/ml庆大霉素和5×10-5M 2-巯基乙醇）调整脾细胞终浓度至1×10⁷/ml,24孔培养板,每孔都加入500μl细胞悬液（约含5×10⁵/ml DCs）和500μl pRBC,然后分别加入10μl LPS（0.5mg/ml）、10μl Lent（1mg/10ml）和2μl Lent（5mg/10ml）,各组一式6孔,取其中3孔培养24h,待流式检测;另3孔培养48h,350×g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待细胞因子测定。实验结果1、感染的BALB/c小鼠原虫血症水平及其生存率为了研究香菇多糖对Py17XL感染BALB/c小鼠感染进程和感染结局的影响,本实验观察了香菇多糖对BALB/c小鼠的虫血症和生存率的作用。pre-15d Lent组感染小鼠原虫血症上升缓慢,于感染后第8d仅达到20%左右,随后缓慢下降,于感染后第15d小鼠痊愈;pre-6d Lent组小鼠于感染后第5d原虫血症仅达到约28%,随后缓慢下降,至感染后第17d原虫血症消失,小鼠生存率为66.7%。Lent组小鼠原虫血症上升缓慢,于感染后第7d出现第一次原虫血症高峰（40%）,至感染后第9d降至30%,随后于感染后第10d再次迅速升高至50%左右,小鼠全部死亡,但生存期明显延长。2、感染的BALB/c小鼠Th1免疫应答IL-12是一种T细胞应答的重要刺激因子,而且与先天性免疫和适应性免疫密切相关。疟原虫感染早期Control组小鼠IL-12分泌水平于感染后第1d达峰值,随后迅速下降pre-15d Lent组、pre-6d Lent组小鼠疟原虫感染早期IL-12分泌水平显著高于Control组（P＜0.01）;而Lent组小鼠能显著上调感染后1d、3d的IL-12的水平（P＜0.05）。感染小鼠IFN-γ分泌水平在感染后第3d达峰值,随后迅速降低。如图（Fig.2B）所示,pre-15d Lent组小鼠感染后IFN-γ水平显著高于Control组,pre-6dLent组小鼠于感染后第3d、5d IFN-γ水出现有意义的升高（P＜0.01）;与Control组相比,Lent组小鼠仅于感染后第3d IFN-γ水平有显著性差异（P＜0.05）。我们取用感染BALB/c小鼠脾细胞培养上清,并测量了其中亚硝酸根的浓度,它是一氧化氮合成量的标识。与Control组相比,Lent不同处理组小鼠于感染后第1d和3d,IL-12水平均出现有意义的升高（P＜0.01）;pre-15d Lent组,于感染后第5d仍具有显著性差异（P＜0.05）。3、感染的BALB/c小鼠Tregs应答Control组小鼠疟原虫感染后Tregs数量迅速增加,并于感染后第5d达峰值。pre-15d Lent组和pre-6d Lent组小鼠Tregs数量在感染后第3d和5d一直保持下降趋势（P＜0.05）,但Lent组感染小鼠Tregs数量未见有意义的变化。Control组感染小鼠CD4⁺T细胞凋亡数量均呈升高趋势,并于感染后第5d达峰值。pre-15d Lent组和pre-6d Lent组小鼠感染后第3d和5d CD4⁺T细胞凋亡数量呈显著性减少（P＜0.05）,但Lent组小鼠CD4⁺T细胞凋亡数量未见有意义的变化。感染小鼠脾细胞培养上清中IL-10分泌水平在感染后第3d达峰值。pre-15d Lent组小鼠IL-10分泌水平显著减少,而pre-6d Lent组小鼠在感染后第1d、3d IL-10分泌水平也呈下降趋势（P＜0.01）,但Lent组小鼠IL-10分泌水平无明显变化。4、CD11c⁺DCs表面分子的表达及其分泌的细胞因子香菇多糖与BALB/c小鼠脾细胞和pRBC（感染红细胞）共同培养24h后,发现Lent（5mg/ml）能够上调小鼠DCs表面的MHC-Ⅱ、CD80和CD86分子表达（P＜0.05）,而且Lent（5mg/ml）还能高表达CD11c⁺DCs表面的TLR2、TLR4（P＜0.05）。IL-12是DCs受刺激后比较特异的一种产物,ELISA结果显示Lent（5mg/ml）能够刺激CD11c⁺DCs分泌高水平的IL-12（P＜0.05）,综合香菇多糖能够诱导CD11c⁺DCs表面高表达MHC-Ⅱ和协同刺激分子的实验结果,充分证明香菇多糖能够促进DCs功能的成熟。结论1、香菇多糖通过增加IL-12、IFN-γ、NO的分泌水平有效激发Py17XL感染的BALB/c小鼠Th1免疫应答的建立。2、香菇多糖通过降低Tregs数量、凋亡CD4⁺T细胞数量以及减少IL-10的分泌水平抑制Tregs应答。3、香菇多糖通过激发CD11c⁺DCs表面的TLR2/TLR4信号途径刺激特异性CD4⁺T细胞的增殖和功能,并上调CD11c⁺DCs表面MHC-Ⅱ、CD80和CD86分子表达,增加IL-12分泌水平,促进DCs功能成熟。