论文部分内容阅读
第一部分、适冷蛋白酶和中温蛋白酶温度适应的分子基础 自1999年以来,实验室开展了对深海适冷微生物和适冷蛋白酶的研究工作。陈秀兰等（2001）从1855米深的海底淤泥中分离到产适冷蛋白酶的适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913,分离纯化了该菌分泌的具有典型适冷特征的适冷蛋白酶MCP—01,对并对其酶学特性进行了系统的研究,研究表明MCP-01为适冷丝氨酸蛋白酶（Chen et al,2002,Chen et al,2003a;Chen et al,2003b）。在此研究基础上,以属于同一家族的中温蛋白酶BP-01为参照,对MCP—01结构与功能的关系进行了系统的研究,揭示了MCP-01高效适冷催化、稳定性差、对热敏感的分子结构基础。 首先克隆了BP—01的基因,根据基因的碱基序列推导出BP-01的氨基酸序列,与潘军（2005）推导的MCP-01的氨基酸序列进行比对,结果表明MCP-01和BP-01的氨基酸序列同源性较低。通过同源模建,分别构建了MCP-01和BP-01的三维结构。MCP-01和BP-01的催化结构域都属于subtilase-S8类型,二者的活性中心的构象相似,由α螺旋和β折叠组成了酶的催化腔,参与催化反应的三个氨基酸残基Asp,Ser和His都位于催化腔内,表明MCP-01和BP-01的催化机制相同。与BP-01相比,MCP-01分子中α螺旋较少,而β转角和无轨卷曲较多,使得分子柔性增强,更易变构,CD光谱检测也证实了这一点。MCP-01和BP-01的变构温度分别为49.5℃和60.2℃,表明MCP-01更易变构。 丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能够完全抑制MCP-01和BP-01的活性,但CD光谱和荧光光谱表明,PMSF对两者的构象没有影响。由于MCP-01活性中心有Ca2+存在,EDTA对MCP-01构象和活性影响较大,α螺旋减少明显减少,而对BP-01的活性和构象没有影响,推测MCP-01的柔性构象需要Ca2+维持其稳定。 盐酸胍通过争夺蛋白质分子中结合的水分子而引起蛋白构象的改变。盐酸胍使两种蛋白酶的荧光发射峰降低,且发生红移,MCP-01红移较大,近20nm,说明MCP-01和BP-01分子中Tyr和Trp的位置及其之间的相互作用存在差别。CD光谱表明,盐酸胍使BP—01和MCP—01二级结构丧失一半的浓度分别1.8M