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土壤盐渍化是一个世界性的资源与生态问题,盐渍化土地遍布世界上一百多个国家和地区,约占世界耕地总面积的20%,我国是土壤盐渍化问题最严重的国家之一。盐渍化土壤通过离子毒害、氧化胁迫、渗透胁迫等,严重影响植物正常生长和作物产量,而植物在长期进化过程中形成了一整套抵御盐胁迫的耐逆机制。紫花苜蓿是世界上重要的牧草资源,但我国的苜蓿产业也受到了土壤盐渍化的严重影响,因此筛选紫花苜蓿耐盐品种、挖掘其耐逆基因、探究其耐逆机制并运用分子生物学手段培育优质耐逆紫花苜蓿新品种显得尤为重要。众多文献表明,MYB转录因子在植物抵御非生物胁迫过程中发挥着重要作用。本文对紫花苜蓿中相对耐盐品种HD和盐敏感品种SD进行NaCl处理下的转录组测序分析,筛选可能的耐盐功能基因。鉴于MYB家族在盐胁迫应答中的重要作用且其在紫花苜蓿中的分离鉴定十分有限,我们首先挑选了17个盐胁迫响应的MsMYBs进行盐胁迫表达分析以验证转录组测序结果并克隆其cDNA全长序列,对于盐胁迫上调最为显著且上调幅度在HD中更高的MsMYB4在拟南芥中过表达,进行MsMYB4耐盐功能的初步鉴定和耐盐机制的初步分析,结果如下:1.紫花苜蓿NaCl处理转录组测序及分析通过对HD及SD两个品种的NaCl处理0、1、24 h全根材料进行转录组测序,经筛选共获得279397个转录本及158126个unigenes。83.57%的unigenes为编码蛋白。转录组测序数据共检测到39338个SSR片段,Mone、Di、Tri片段占比超过98%,Tetra、Penta、Hexa占比不到2%。DEGs的聚类分析显示主要存在两个组类,第一个组是HD-24和SD-24中的unigenes,第二个组是HD-0、HD-1、SD-0、SD-1中的unigenes,而其中又分为两个亚组,一个是HD-0、SD-0中的unigenes,第二个亚组是HD-1、SD-1中的unigenes。经分析发现HD-1 vs HD-0存在935个差异表达基因,HD-24 vs HD-0存在2809个差异表达基因;SD-1 vs SD-0存在1456个差异表达基因,SD-24 vs SD-0存在3356个差异表达基因;HD-0 vs SD-0存在629个差异表达基因,HD-1 vs SD-1存在681个差异表达基因,HD-24 vs SD-24存在657个差异表达基因。在整个Na Cl处理过程中,HD品种中有178个基因始终处于上调表达,341个基因始终处于下调表达;而在SD中有244个基因始终处于上调表达,694个基因始终处于下调表达。还存在着113个基因在对照及处理组的HD和SD中均存在差异。DEGs的GO分析证明,HD-1 vs HD-0中,我们发现了35个GO Term被富集,HD-24 vs HD-0中,50个GO Term被富集,SD-1 vs SD-0中,45个GO Term被富集,SD-24 vs SD-0中,49个GO Term被富集,HD-0 vs SD-0中,7个GO Term被富集,HD-1 vs SD-1中,27个GO Term被富集,HD-24 vs SD-24中,19个GO Term被富集。KEGG通路分析显示,HD-1 vs HD-0中,367个差异表达基因富集在85个通路,HD-24 vs HD-0中,1334个DEGs富集在108个通路,SD-1 vs SD-0中,534个DEGs富集在99个通路,SD-24 vs SD-0中,1447个基因富集在114个通路,HD-0 vs SD-0中,207个DEGs富集在64个通路中,HD-1 vs SD-1中,222个DEGs富集在73个通路中,HD-24 vs SD-24中,244个DEGs富集在76个通路中。2.紫花苜蓿盐胁迫响应MYB转录因子的挖掘从转录组测序差异表达基因中挑选了17个MsMYBs转录因子,并利用Realtime-PCR验证其转录组测序数据。进一步克隆得到其cDNA全长序列并将其分别命名为MsMYB1-17,经序列分析发现,这17个MYBs均含有保守的R结构域及相关保守残基且均属于R2R3亚族,它们分别位于发育树中的S2、S3、S4、S8、S14、S15、S17、S20、S22、S24亚族。3.紫花苜蓿MsMYB4基因耐盐功能初步鉴定经研究发现,MsMYB4-OE拟南芥植株在NaCl处理下较野生型表现出更好的种子萌发及根系生长现象:无NaCl条件下,野生型及MsMYB4-OE系的种子萌发率均为100%,经150 mM NaCl处理后,野生型拟南芥种子萌发率为60%而两个过表达系种子萌发率仍高达84.4%和82.3%;无NaCl条件下,野生型与过表达株系的根系生长状况相近,而经NaCl处理后过表达株系的根系长度明显好于野生型拟南芥。外源ABA处理时,MsMYB4-OE拟南芥植株也表现出了更高的抗性:野生型拟南芥的种子萌发率从100%(0μM ABA)下降至80%(1μM ABA),进而衰减至60%(2μM ABA),而过表达株系拟南芥在上述三个ABA浓度下的萌发率明显较高,依次为100%,95%,80%。野生型拟南芥经2μM ABA处理后根系生长仅能保持对照组的23%,而过表达株系的根系生长却依然能够保持45%。综上所述,紫花苜蓿品种HD和SD在NaCl处理时,有大量参与一级和二级代谢的转录调控因子、信号转导因子和编码蛋白基因,其表达被不同程度地诱导或抑制,且其中的部分基因,其表达受盐胁迫上调或下调的幅度或模式在HD和SD中有差异。经分析推测,我们挑选并克隆了可能在紫花苜蓿盐胁迫信号转导途径中发挥作用的17个MsMYBs。经MsMYB4拟南芥过表达实验,发现紫花苜蓿MsMYB4基因显著提高了植物的耐盐性以及对ABA的抗性,这说明该基因很可能是紫花苜蓿中的一个关键的耐盐基因,且通过ABA依赖的耐逆途径发挥作用。