论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌是一种主要定植在人和动物皮肤表面、鼻咽部的革兰氏阳性胞外菌,感染后会引起人和动物的多种疾病,如脓皮症,败血症,乳房炎,关节炎等,严重威胁公共卫生安全。TSST-1是金黄色葡萄球菌的一种重要的毒力因子,属于超抗原毒素家族,在金黄色葡萄球菌致病机制中发挥着重要的作用。TSST-1具有A、B两个结构域,同其他超抗原毒素一样,可以直接通过抗原递呈细胞上的MHC II类分子,与Toll样受体分子的Vβ区结合,从而激活T细胞,引起大量炎性细胞增殖和炎性因子的产生。已有研究表明,金黄色葡萄球菌可以通过激活天然免疫模式受体中的Toll样受体和NOD样受体促进前炎细胞因子、抗炎细胞因子以及趋化因子的产生进而引发机体炎症反应,但是目前暂无关于TSST-1与宿主细胞炎症反应相关的研究。本试验在对重庆部分地区山羊鼻腔中分离到的金黄色葡萄球菌进行基因分型发现,tst1基因携带率较高。基于此我们原核表达纯化了重组TSST-1毒素,用TSST-1刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,利用荧光定量RT-PCR,ELISA和Western Blot等技术,研究TSST-1诱导巨噬细胞炎症反应及其相关机制,试验结果如下:1.调查重庆地区山羊源性金黄色葡萄球菌流行特点及耐药情况本试验从重庆市西部和东部地区山羊养殖场中采取了167份山羊鼻拭子样本,进行了金黄色葡萄球菌的分离鉴定、超抗原毒素基因检测、基因分型和耐药性分析试验。分离鉴定出金黄色葡萄球菌45株,总检出率为26.9%（45/167）。其中大足地区的检出率最高,为29.8%（26/45）。MLVA分子分型得到27个不同的MT型,辛普森指数最高为0.8707。根据分型绘制进化树,可见同一地区的分离株具有高度相似性。超抗原毒素基因检测结果显示,sel和tst1检出率最高,为20%（9/45）,其次是sec,为17.8%（8/45）。超抗原毒素基因分型结果中可观察到8种不同的基因类型,其中以sec-sel-tst1型最多,占8.9%（4/45）。本试验中的金黄色葡萄球菌对青霉素耐药率最高,达71.11%（32/45）,其次是复方新诺明,达31.11%（14/45）。分离株中耐3种以上抗生素的有1株,多重耐药率为2.2%。2.金葡菌超抗原毒素TSST-1对巨噬细胞的致炎作用将TSST-1基因重组质粒pGEX-6P-1导入大肠杆菌模式菌株Ecoli.BL21,诱导表达并经过纯化后得到重组金葡菌超抗原毒素TSST-1。利用TSST-1刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中炎症相关因子IL-1α、L-1β、TNFα和IL-6的分泌水平,结果显示,在ATP的作用下,TSST-1能够显著引起上述炎症因子的分泌。已知TSST-1毒素的135号氨基酸由组氨酸突变成丙氨酸后会失去其超抗原活性,用同样的方法得到突变的超抗原毒素,mTSST-1。利用mTSST-1刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中炎症因子的分泌水平,结果显示,在ATP的作用下也能引起上述炎症因子的分泌,且与TSST-1无显著差异。以上结果表明,TSST-1能够在第二信号ATP的作用下对小鼠腹腔巨噬细胞产生致炎作用,且与其超抗原活性无关。3.TSST-1通过TLR4诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体激活为研究TSST-1刺激巨噬细胞中炎症小体对IL-1β成熟与分泌的影响,利用TSST-1+ATP分别感染野生型小鼠WT和炎症小体组分缺失小鼠(Nlrp3-/-、Caspase-1-/-、Asc-/-)腹腔巨噬细胞,ELISA检测炎性相关细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌情况,同时Western Blot检测感染后Caspase-1的活化情况。结果显示,感染后IL-1β的分泌量在3种基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中显著下降。为探索何种细胞表面受体参与了对TSST-1的识别,我们利用TSST-1+ATP感染野生型小鼠和TLR2、TLR4组分缺失小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中炎症因子IL-1β的分泌水平变化,结果显示TLR4敲除后,IL-1β的分泌明显下降。RT-PCR检测TSST-1+ATP感染WT和Tlr4-/-小鼠巨噬细胞后IL-1β的分泌情况也显示,TLR4介导的信号通路参与了IL-1β的产生过程。以上结果共同说明TSST-1+ATP感染后,TLR4受体识别信号并引起下游炎症相关信号通路激活,诱导NLRP3炎症小体活化,从而使Caspase-1激活并切割pro-IL-1β,使之成熟并分泌。