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奶牛乳房炎是一种发病率高且复杂的乳腺综合性疾病,给奶牛业造成了严重的经济损失,对人类的健康也有巨大威胁。乳房炎主要是由革兰氏阴性菌和阳性致病菌共同引起,其中革兰氏阴性细菌约占所有病原体的40%。大肠杆菌是主要的革兰氏阴性致病菌,可通过细胞壁内毒素脂多糖（LPS）引起乳房炎并诱发级联炎症。蛋氨酸二肽（Met-Met）是一种功能性小肽,在奶牛乳蛋白合成以及胚胎发育等过程中的作用已被阐明,但其是否具有缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症的功能尚不清楚。本论文以LPS和促炎因子TNF-α刺激奶牛乳腺上皮细胞为炎症模型,利用代谢组学、转录组学及基因沉默等技术手段,研究了 Met-Met对奶牛乳腺上皮细胞炎症的影响及其作用机制。具体内容如下:1.Met-Met对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症的影响研究本章旨在研究Met-Met对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症的影响。试验采用不同浓度Met-Met和LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,在不同时间点检测细胞活力、炎症因子和炎症介质的表达变化。结果表明,2mMMet-Met在3、6小时显著促进了细胞活力,而5、10 mM的Met-Met在24小时表现出细胞毒性（P<0.05）,后续选用2 mM Met-Met处理6小时进行试验处理。与对照组相比,LPS在1小时可快速诱导炎症因子TNF-α,IL-8,IL-1β的表达,在3小时其表达达到峰值（Ptreatment<0.05）,而2 mM Met-Met预处理显著下调了 TNF-α（Ptreatment＜0.05）、IL-8（P treatment<0.01）及 IL-1β（P treatment＜0.05）的表达量。与LPS组相比,在不同时间点2 mM Met-Met均可显著抑制炎症介质AP-1的表达（P<0.05）,且不同浓度的Met-Met对TNF-α和IL-1β的丰度表现出浓度依赖性抑制作用。2 mMMet-Met亦可显著减少MAC-T细胞TNF-α（P<0.05）和IL-8（P<0.01）的胞外分泌量。基于细胞分泌到胞外的TNF-α含量,进一步设置3个梯度的TNF-α刺激MAC-T细胞,以模拟细胞因子引起的级联炎症反应,通过检测炎症相关基因的表达进一步研究Met-Met的抗炎功能。结果显示,与TNF-α组相比,2 mM Met-Met对低、中、高浓度的TNF-α（P<0.05）及其诱导产生的IL-8均表现出显著抑制作用（P<0.01）。以上结果表明:Met-Met对LPS引起的乳腺上皮细胞炎症具有缓解作用,并可抑制由LPS诱导的TNF-α级联炎症反应。2.Met-Met缓解LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的代谢机制研究基于非靶向代谢组学分析,本章研究了 Met-Met缓解LPS诱导乳腺上皮细胞炎症的代谢机制。试验分为CON组、LPS组、Met-Met+LPS组以及Met-Met组,各组相应处理后收集细胞,用于代谢组学分析。结果显示:与对照组相比,各处理组的整体代谢谱发生显著变化。LPS vs.CON组下调差异代谢物（DMs）数目显著高于上调DMs数目（P<0.01）;代谢物-代谢物互作网络分析发现DMs主要为腺苷一磷酸、腺嘌呤、亮氨酸、磷酰胆碱等;KEGG富集分析发现,差异代谢物主要富集于嘌呤代谢、缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸的合成与分解以及甘油磷脂代谢通路。LPS vs.CON和Met-Met+LPS vs.LPS交集组共有17个重叠DMs,其中10个在LPS vs.CON组中上调并在Met-Met+LPS vs.LPS组下调,7个在LPS vs.CON组下调并在Met-Met+LPS vs.LPS组上调;代谢物-代谢物互作网络分析发现DMs主要为色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、腺苷一磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、恩贝酸、棕榈酸等;KEGG通路分析表明重叠DMs主要富集于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的合成与分解,氨酰-tRNA的合成、嘌呤代谢、非不饱和脂肪酸的合成等通路。Met-Metvs CON组DMs中权重最显著的是L-蛋氨酸、S-甲硫-5’-腺苷、苯乙酸、腺嘌呤、腺苷一磷酸、尿苷5’-单磷酸及尿苷5’-二磷酸;KEGG富集分析表明DMs显著富集于半胱氨酸、蛋氨酸代谢,嘧啶代谢,嘌呤代谢,烟酸和烟酰胺代谢,氨酰-tRNA合成通路等。以上结果提示,奶牛乳腺上皮细胞发生炎症时其代谢物发生了显著变化,Met-Met主要通过调控氨基酸、嘌呤及脂肪酸等代谢通路缓解乳腺上皮细胞炎症。3.Met-Met缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症的转录机制研究基于转录组学分析,研究了 Met-Met缓解LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症的机制。试验设计同2,各组相应处理后,用于转录组学和qPCR分析。结果显示:与对照组相比,各处理组的转录谱发生明显变化。LPS vs.CON组上调基因数目显著高于下调基因数目（P<0.01）;蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析发现核心基因（Hub gene）主要是与 CXCL2,CXCL8,TNF,CSF2,NFKBIA 等炎症相关基因;GO富集分析发现差异基因（DEGs）主要参与炎症应答、细胞因子调节等生物学过程;KEGG富集分析发现,差异基因主要富集于NFκB、MAPK、TNF等炎症相关的信号通路。LPS vs.CON&Met-Met+LPS vs.LPS交集组共有46个重叠基因,其中40个在LPS vs.CON组上调并在Met-Met+LPS vs.LPS组下调,6个在LPS vs.CON组下调并在Met-Met+LPS vs.LPS组中调;GO富集分析发现重叠基因主要参与脂多糖响应及炎症应答等生物学过程;KEGG通路分析表明重叠基因主要富集于NFκB、MAPK和IL-17等信号通路。Met-Met vs.CON组下调基因数目显著高于上调基因数目（P＜0.01）;PPI网络分析发现核心基因主要是与炎症及组蛋白泛素化过程相关的基因,如SIPR1,CCR7,HCAR1,CXCL2,IL-1A等,提示这些基因可能参与Met-Met抗炎;GO富集分析发现DEGs主要参与氨基酸分解代谢、激酶活性调节等生物学过程;KEGG富集分析表明DEGs显著富集于JAK-STAT信号通路、甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸等代谢通路。以上结果表明,乳腺上皮细胞发生炎症时诱发大量基因表达改变,Met-Met可能通过NFκB、MAPK和JAK2-STAT5信号通路缓解乳腺上皮细胞炎症。4.JAK2-STAT5、NFκB/MAPK通路在Met-Met抗炎过程中的调控机制研究本章旨在研究JAK2-STAT5、NFκB/MAPK通路在Met-Met缓解奶牛乳房细胞炎症过程中的调控机制。试验比较了 LPS和Met-Met+LPS在不同时间点（0、15、30、45、60、90 分钟）的 JAK2-STAT5、NFκB/MAPK 通路蛋白表达量。并在JAK2基因沉默条件下,检测了转录谱筛选出的JAK2-STAT5、NFκB、MAPK信号通路蛋白的磷酸化和非磷酸化水平。结果表明,Met-Met在30-60分钟可快速激活 p-JAK2/JAK2（P<0.01）,p-STAT5/STAT5（P<0.05）并显著抑制 p-IκB/IκB,p-NFκB/NFκB（P<0.05）和 p-P38/P38,p-JNK/JNK（P<0.01）,而促进 p-ERK1/2/ERK1/2（P<0.05）磷酸化;干扰JAK2显著降低了 JAK2、STAT5的磷酸化及非磷酸化水平（P<0.01）,并显著逆转了炎症状态下由Met-Met介导的p-IκB、NFκB和JNK的抑制（P<0.05）,而对p-P38的激活没有影响。以上结果表明,Met-Met通过激活JAK2-STAT5进而抑制NFκB和部分MAPK信号通路发挥抗炎作用,其中JAK2的激活是Met-Met发挥抗炎作用的必要条件。综上所述,奶牛乳腺上皮细胞炎症发生时,抗炎性氨基酸减少,促炎性脂肪酸增加,嘌呤代谢紊乱。Met-Met通过激活JAK2-STAT5通路继而抑制NFκB和MAPK通路缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症,并有效改善乳腺上皮细胞代谢紊乱。此研究为开发Met-Met功能性寡肽以提高动物免疫力提供了理论依据。