刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)作为一种专性细胞寄生性原虫,具有广泛的宿主群,在世界范围内广泛流行,猪、牛、羊、马、犬等均易感,猫是其终末宿主。猪爆发弓形虫病时,可使整个猪场发病,死亡率高达60%以上,造成巨大的经济损失。血清学调查结果表明,全世界约有25%的人受感染。之所以人群中弓形虫会具有如此高的感染率,除其多呈隐性感染外,一个重要的因素就是其传播途径的普遍性。目前我国养宠物的人越来越多,生食海鲜,喜好野味,喜食未煮熟的肉类、蛋类等不良饮食习惯,使得弓形虫病在人群中广泛传播。随着经济发展,人群流动性越来越大,弓形虫病开始在非流行区播散,弓形虫感染具有上升的潜在危险。目前对人弓形虫病的治疗尚无有效药物,仍以预防为主；对牲畜的弓形虫病的治疗仍以化学药物为主,一般可用磺胺类药物与抗菌增效剂合用,但日益增加的药物残留、耐药性产生迫切需要探究新的防治方法。疫苗作为一种新的有效的防治策略,具有广泛的应用前景。由于弓形虫抗原成分繁多,生活史复杂,目前尚未有效的抗弓形虫病疫苗。弓形虫微线体MIC3蛋白对弓形虫入侵宿主细胞发挥着重要作用,由于MIC3能在弓形虫各个阶段表达,被认为是预防弓形虫病重要的疫苗候选因子。本研究通过生物信息学、分子生物学、基因工程学、免疫生物学等方法对弓形虫微线体蛋白MIC3进行功能的研究,试图进一步了解MIC3及其相关蛋白的未知功能,分析其抗原性,为弓形虫病疫苗研制提供新的方法。1.弓形虫MIC3基因DNA克隆及生物信息学分析参照ToxoDB (www.ToxoDB.org)上弓形虫基因组序列设计引物,分别以弓形虫RH(Ⅰ型)、GT1(Ⅰ型)、PTG(Ⅱ型)、CTG(Ⅲ型)四种虫株DNA为模板,PCR扩增MIC3基因及其两个侧翼区,并克隆到T载体上。在此基础上,对四种虫株的MIC3序列进行同源性比较,分析各种虫株的亲缘性及其进化关系；通过在线软件分析MIC3基因5’UTR区的转录活性以及MIC3蛋白的基本参数及其抗原性,利用在线结构域预测软件、模型预测及构建软件对MIC3蛋白各功能域的结构、位置、功能等进行分析、预测,根据软件预测得到的信息及MIC3蛋白的研究资料进行模拟MIC3蛋白高级结构,初步建立MIC3蛋白的模型。对弓形虫MIC3基因的生物信息学分析为我们进一步对MIC3蛋白功能等相关研究的开展提供了重要信息。2.微线体蛋白MIC3基因5’上游序列转录活性分析及MIC3细胞定位的研究弓形虫微线体蛋白MIC3是由微线体分泌的一种粘附性蛋白,在弓形虫入侵宿主细胞早期发挥重要作用。为进一步分析MIC3基因的5’侧翼区的转录活性及MIC3蛋白的细胞定位,我们构建了以弓形虫MIC35’UTR启动的绿色荧光蛋白虫株及表达绿色荧光标记的MIC3基因的虫株。通过PCR扩增MIC3基因的5’UTR,利用限制性内切酶将其与绿色荧光蛋白基因EGFP相连接,为了使EGFP的顺利表达,在EGFP基因之后插入了弓形虫SAGl基因的3’UTR,并在构建好的基因后面连接带有SAG1启动子的Ble基因(Ble基因是一种分子选择标签,具有腐草霉素抗性,以便基因工程株的筛选),构建成pBSK-5’flanking-egfp SAGl 3’UTR荧光表达质粒,同样的方法可构建荧光标记MIC3基因的虫株。通过RT-PCR、荧光电子显微镜验证目的基因的表达情况、分析MIC3基因的5’侧翼区的转录活性及研究MIC3基因的细胞定位。结果表明,MIC3基因的5’侧翼区能够启动绿色荧光蛋白EGFP基因的表达,微线体MIC3蛋白于虫体入侵宿主细胞早期分泌于虫体顶端,依附于细胞表面以利于弓形虫入侵。3.弓形虫微线体蛋白MIC3过量表达对虫体的影响为探讨弓形虫微线体MIC3的过量表达对虫体入侵、生长、增殖等影响,我们构建了MIC3过表达虫株。通过PCR扩增MIC3基因,将其与弓形虫SAG1的3’UTR相连接,利用限制性内切酶将融合基因片段插入表达载体pBSK中,为了确保该基因片段正确表达,在其前端插入鉴定过的MIC35’UTR作为启动子序列；再在该载体上插入以弓形虫膜蛋白启动子SAG1启动的选择性标签Ble基因,以确保构建好的基因工程株的顺利筛选。通过电转染技术将构建好的pBSK-5’ flanking-MIC3 SAG1 3’UTR-SAGl pro-ble过表达质粒载体转入弓形虫中,并利用腐草霉素筛选阳性虫株。通过噬斑实验、入侵实验等证明,在弓形虫RH株中,微线体MIC3蛋白的过量表达对该虫株的入侵、生长、增殖等有微弱的影响,这可能与弓形虫在入侵过程中有多个蛋白相互协作相关。该研究为进一步研究MIC3的功能奠定了基础。4.弓形虫重组蛋白MIC3的免疫原性研究利用PCR技术从构建好的载体pUCm-MIC3扩增出MIC3基因片段,克隆入pET30a原核表达载体,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导重组蛋白的表达。用镍柱纯化后的重组蛋白免疫ICR小鼠,探讨弓形虫MIC3融合蛋白的免疫效果及人参皂甙佐剂的辅助性功能。试验分四组：MIC3融合蛋白、MIC3融合蛋白+50μg Rg1、MIC3融合蛋白+弗氏佐剂及生理盐水对照组,每组20只ICR小鼠,按照每只小鼠100μg融合蛋白的剂量进行首免,2周后二免,免疫前和一免后每隔2周眼眶采血分离血清进行特异性抗体检测,持续至一免后8周：二免后2周取脾脏,分离淋巴细胞,用于淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测；二免四周后按每只小鼠500个速殖子的剂量腹腔注射,观察小鼠的死亡状况以评价其免疫保护效果。结果表明重组蛋白MIC3能显著提高淋巴细胞的增殖水平和机体对融合蛋白免疫应答水平；MIC3融合蛋白+弗氏佐剂免疫组的免疫保护性最好,人参皂甙+MIC3融合蛋白免疫组次之。综上,MIC3融合蛋白对实验感染弓形虫小鼠具有一定的免疫保护效果,免疫佐剂对融合蛋白有协同作用,人参皂甙、弗氏佐剂能显著提高小鼠对MIC3融合蛋白免疫应答水平。5.减毒沙门氏菌为载体传递弓形虫MIC3/P30基因的免疫原性研究将PCR扩增的弓形虫MIC3、P30基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3.1-MIC3、pcDNA3.1-P30、pcDNA3.1-MIC3/P30真核表达质粒,高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,将携带弓形虫MIC3、P30基因的真核表达质粒的重组减毒沙门氏菌ZJ111/pcDNA3.1-MIC3、ZJ111/pcDNA3.1-P30、ZJ111/pcDNA3.1-P30/MIC3株,分别以107cfu的剂量进行首免,二周后以同样的剂量进行二免。二免后6周各组小鼠的体重无统计学差异(P>0.05),同时肝脏和脾脏已检测不到沙门氏菌；用限制性酶切分析和PCR鉴定证实,体内、体外的重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定;将含一免后每隔2周采血1次进行特异性抗体检测,持续至一免后8周：二免后2周取脾脏,分离淋巴细胞,用于淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测；二免后2周以500个速殖子/只小鼠攻毒,观察小鼠的死亡情况。结果表明：利用减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性和稳定性；三个重组减毒沙门氏菌组均能显著增强淋巴细胞增殖水平和抗体水平(P<0.05),显著提高机体INF-γ分泌；攻毒试验表明：免疫组能够延缓攻毒小鼠死亡,ZJ111/pcDN A3.1-P30/MIC3免疫组小鼠在攻毒后第十二天的存活率为20%。研究结果表明：以减毒沙门氏菌传递弓形虫MIC3、P30基因具有良好的免疫原性和一定的免疫保护效果,多基因表位疫苗比单个疫苗对小鼠有更好的抗弓形虫感染作用。综上,本研究通过生物信息学方法对弓形虫MIC3基因进行系统分析,比较了四种虫株基因差异情况及进化关系,预测了MIC3蛋白的结构域及空间结构；构建了弓形虫表达绿色荧光蛋白及标记目标蛋白技术,利用该体系观察了MIC3蛋白的分泌及细胞定位情况,并对MIC3蛋白过表达对虫体的影响进行了评测；构建了减毒沙门氏菌为载体传递弓形虫抗原的DNA疫苗,通过MIC3抗原性、人参皂甙Rg1疫苗辅助性、多基因表位抗原性以及减毒沙门氏菌为载体传递基因工程疫苗四个角度来分析及比较弓形虫蛋白MIC3作为疫苗的可能性及其前景,从而为弓形虫疫苗的开发提供新的思路及方法。