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前言 结直肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，占女性癌症病死率的第三位，男性病死率的第四位，每年有一百多万的新发病例，对人类的健康和生命有着严重危害。尽管过去30年来，结直肠癌患者的5年生存率有所提高，但是结直肠的发病机制尚不明确，转移是影响患者疗效和死亡的主要原因，临床上多数结直肠癌患者在进行根治性手术前已出现微转移，并且是结直肠癌术后转移和复发的直接原因。因此对结直肠癌转移的分子机制进行深入研究，是结直肠癌研究的重要内容。 microRNA(miRNA)是一类广泛存在于多种生物体内的长度约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3非转录区(3untranslatedregion，3UTR)完全或不完全结合，降解靶基因mRNA或者抑制其翻译，从而具有在转录后水平调节基因表达的作用。生物信息学分析人类基因库中约30％基因受miRNA调控。对下游基因的调控使miRNA可参与生物体生长发育和分化等，其失衡亦可促进多种肿瘤的发生发展。到目前为止，140多种物种中的15000个miRNA被鉴定出，但其在临床中的功能及应用尚不明确。 近来研究发现多种miRNA在大肠癌组织及大肠癌细胞系中异常表达，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等基本活动，进一步明确miRNAs在CRC发病机制中的作用有助于提高CRC的诊治水平。miR-34a是新近发现的miRNA，其在结直肠癌中的表达及其调控靶基因罕见研究报道。本实验旨在观察结直肠癌与癌旁组织中miR-34a的表达情况，其表达与临床病理因素间的关系，研究其过表达对下游靶基因蛋白表达的影响，及对结直肠癌细胞侵袭、转移中的作用。拟为临床抗结直肠癌的发生发展等提供新的基因靶点。 方法 1、荧光实时定量RT-PCR方法检测miR-34a在100例结直肠癌和癌旁组织，4种结肠癌细胞和人间皮瘤细胞株中的表达情况;将RT-PCR结果与这些组织样本的的临床病理特征联系并进行统计学分析。 2、以miR-34a低表达的人肠癌HCT-116及ClonA1细胞株为研究工具细胞，应用三种生物信息学软件和在线网络数据库对miR-34a的靶基因进行预测，分析结合位点;通过对靶基因mRNA、蛋白表达产物的检测，确定miR-34a对靶基因的调控方式;并进一步采用RT-PCR、WesternBlot和免疫组化方法检测靶向蛋白在结直肠癌组织细胞及其他肿瘤细胞中的表达情况。 3、购买miR-34a过表达慢病毒及阴性对照病毒;常规培养HCT-116及ClonA1细胞，以慢病毒转染细胞，后用荧光显微镜观察，RT-PCR检测转染效率，观察下游蛋白，用RT-PCR和WesternBlot，Elisa法检测稳转细胞株靶基因VEGF和pFAK的mRNA及蛋白表达情况，筛选出干预效果最好的各组稳转细胞株用于后续实验。 4、以稳定转染后的LV-34a-HCT-116/LV-NC-HCT-116和LV-34a-ClonA1/LV-NC-ClonA1为研究对象，应用Transwell及划痕实验检测细胞的迁移及侵袭能力，应用CCK-8实验检测四组细胞的增殖能力;应用流式细胞仪检测四组细胞的细胞周期分布;应用Hoechst及流式细胞仪检测四组细胞的凋亡情况。 5、以稳定转染后的LV-34a-HCT-116/LV-NC-HCT-116和LV-34a-ClonA1/LV-NC-ClonA1为研究对象，在细胞培养液中加入商品化VEGF，RT-PCR及WesternBlot检测下游FAK及pFAK表达。 结果 1、miR-34a在结直肠癌及癌旁组织和结直肠细胞株中的表达:检测的100例结直肠癌组织中miR-34a的表达较癌旁组织下调;miR-34a在肠癌细胞株HCT-116，ClonA1，HT-29，CL-187中的表达水平均较人间皮瘤细胞HMrSV5下调，结果与组织中的表达情况一致。结合临床病理特征分析显示，miR-34a低表达与结直肠癌组织分化程度，淋巴结转移及TNM分期相关，而与性别，年龄，肿瘤位置和肿瘤大小等其他临床病理特征无关。 2、生物信息学分析:MiRanda3.3a、RNAhybrid2.1、TargetSpy三种软件和三种在线数据库TargetScan，miRBase，PicTaralgorithms预测了miR-34a的靶基因VEGF;Blast数据库比对表明，VEGF的3UTR区存在与miR-34a5端相互作用的序列，且此结合位点与miR-34a的种子序列吻合。RT-PCR和WesternBlot的方法检测到miR-34a能在蛋白表达水平下调VEGF，而不改变VEGFmRNA水平。同时检测到VEGF下游FAK总蛋白表达无改变，但其磷酸化形式pFAK表达明显下降。 pFAK在结直肠癌组织中蛋白表达较正常肠粘膜组织明显升高;免疫组化分析显示其在结直肠癌组织中表达为+++，在癌旁组织中表达为++，而在正常肠粘膜组织为+。 3、定购miR-34a慢病毒及其阴性对照病毒;将病毒转染进HCT-116和ClonA1细胞株，荧光显微镜下可观察到强烈的绿色荧光;RT-PCR检测转染效率，可达80％，westernblot结果发现miR-34a能抑制靶基因VEGF和pFAK蛋白水平的表达。 4、miR-34a对HCT-116及ClonA1细胞生物学行为影响的实验研究:利用Boyden侵袭小室和划痕实验检测实验组及对照组细胞株中细胞的体外侵袭能力变化，统计结果显示，HCT-116和ClonA1细胞株中，miR-34a过表达组较NC组的侵袭能力具有显著性差异(p=0.041，p=0.032)。CCK-8实验显示，miR-34a过表达后，两种细胞株增殖能力无明显改变(p＞0.05);而细胞周期检测结果显示，miR-34a过表达后，对两种细胞的细胞周期影响并不大;凋亡实验发现，稳定转染后，过表达组细胞的凋亡明显增加(p＜0.05)。 结论 本研究证实了miR-34a在结直肠癌中可靶向调控VEGF。miR-34a通过与VEGFmRNA3"UTR中的互补位点结合，在翻译水平抑制VEGF的表达，VEGF是FAK的转录因子和上游激活剂，VEGF表达降低后，FAK总蛋白表达无改变，但其pFAK蛋白表达明显降低。miR-34a在结直肠癌组织中表达异常降低或缺失，而恢复或上调miR-34a的表达可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，同时可促进细胞凋亡，因此，miR-34a有望成为一个抗结直肠癌转移及治疗的靶点。