论文部分内容阅读
背景:胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，统计资料表明其发生率约占颅内肿瘤的40-50％，其多呈浸润性生长，与正常脑组织间常无明显分界，易侵犯重要神经结构，具有预后差、复发率、高致死率的特点。传统的治疗方法包括手术切除为主，辅以放疗、化疗，血脑屏障的存在使常规化疗药物难以发挥作用，预后不佳。随着分子生物学的发展寻找新的治疗手段成为是神经外科研究领域的主要内容之一。 促肾上腺激素释放因子(corticotropin-releasing factor CRF)是1981年Vale等从绵羊的下丘脑中提取分离出的含有41个氨基酸的激素类神经肽[1]。多分布于人类中枢神经系统下丘脑室旁核，外周系统中也分布广泛。CRF主要作用于下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA），调节机体在应激状态下的神经内分泌，自主神经，免疫反应等方面的协调作用[4]。近年来许多文献报导CRF相关肽及其受体在许多肿瘤细胞生长中都发挥了重要的作用。如Grazia等发现CRF能通过CRFR1来抑制人类子宫内膜癌[2]细胞和乳腺癌细胞[3]的增殖;Erini等发现CRF通过激活CRFR1诱导PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞凋亡[5];并且Minas等也发现CRF通过激活CRFR1来增加FasL在卵巢癌细胞中的表达，进而促进卵巢癌细胞凋亡[6]。但是，CRF对脑胶质瘤的作用及机制国内外鲜有报道。我们设计并实施了本实验。 目的:探索CRF及其受体抑制剂Antalarmin作用于人脑胶质瘤U87MG细胞后，对比细胞内的cAMP、PKA含量的变化。探讨CRF及其受体在环磷腺苷酸-蛋白激酶A通路(cAMP-PKA)中的信号传导，以及对U87细胞凋亡的影响。 方法: 1、Elisa方法法检测cAMP的浓度 复苏U87细胞接种于6孔培养板中，每组置3个重复孔。37℃，5％CO2，湿化空气培养24h后，分别加入①DMEM培养基作为空白对照、②含CRF的DMEM培养基（浓度为10-9mol/L）、③含Antalarmin的DMEM培养基（浓度为10-8mol/L）、④含CRF和的DMEM培养基（浓度为别为10-9mol/L、10-8mol/L）2mL，作用24小时后，低温离心提取细胞，加入IBMX1mL（浓度为1mg/mL）后，超声裂解法裂解细胞，低温离心提取上清液后，在吸光度值检测仪中检测cAMP浓度。 2、荧光定量PCR检测PKA基因表达 Trizol法提取细胞总RNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按反转录试剂盒说明书合成cDNA，进行聚合酶链反应。应用Primer Premier5.0软件，设计目的基因和内参基因，由北京赛百盛公司合成。置于QIAGENRotor-Gene Q Real Time RT-PCR仪，95℃预变性2min;95℃变性15s，60℃退火/延伸30s，40个循环;最后，采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析[7]，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异，记录结果数据。 结果: 1、Elisa检测细胞内cAMP:同时间组的，不同处理的细胞样本存在差异，(F12h=8.181,P=0.008＜0.05; F24h=7.821, P=0.009＜0.05;F36h=5.820,P=0.021＜0.05);不同时间组的cAMP浓度存在减少趋势。 2、荧光定量PCR检测:相同时间不同处理方式各组的PKA的mPNA表达有差别(F12h=175.926，P＜0.05;F24h=137.956，P＜0.05; F36h=129.280，P＜0.05)，其中均表明CRF处理组的PKA的mPNA表达高于同时间点其它处理组。 结论: 1、Elisa实验结果显示:CRF作用于U87细胞后，增加细胞内cAMP的浓度，可能通过第二信使cAMP促进细胞凋亡的作用，且随时间推移，细胞内cAMP的浓度减低。 2、荧光定量PCR结果显示:PKA的mRNA的表达与细胞内cAMP的表达趋势一致。结合以前研究CRF与U87细胞凋亡关系密切，CRF促进U87细胞凋亡。 综上所述，CRF在促进了U87细胞的凋亡途径上可通过cAMP-PKA信号转导系统发挥作用。