研究背景：1965年,美国科学家Blumberg首次在澳大利亚土著人血清中发现“澳大利亚抗原”。其随后被确定为乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg),是乙肝病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染后最早出现于患者血清中的HBV标志物。若HBsAg在患者血清中持续时间超过6个月,即可诊断为慢性乙型肝炎病毒感染(Chronic hepatitis B, CHB)。据世界卫生组织WHO报道,全世界有3.5亿左右慢性HBV感染者,每年大约有100万人因HBV感染引起的并发症而死亡。如肝硬化(Cirrosis)、肝衰竭(Liver faliure)和原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)。因此,慢性乙型肝炎患者的管理与治疗是个艰巨而意义重大的任务。乙肝病毒E抗原(Hepatitis B e antigen, HBeAg)与HBsAg同时或稍晚出现于感染者血清中,是乙肝病毒在体内复制活跃的标志之一。在慢乙肝患者管理与治疗过程中,若出现HBsAg或HBeAg消失,并产生表面抗体(Hepatitis B surface antibody, HBsAb)或E抗体(Hepatitis B e antibody, HBeAb),即发生血清学转换(Seroconversion)。通常意味着体内乙肝病毒复制活性降低,病情好转,是常用的评估病情和治疗效果的指标,是重要的临床治疗终点。越来越多的临床研究发现,治疗前血清HBsAg和HBeAg(?)低水平与其高血清学转换率密切相关。随着检测技术的发展,定量检测HBsAg和HBeAg水平己成为可能。这为我们深入探讨HBsAg和HBeAg水平及其变化模式评估HBV抗病毒疗效提供了新手段。因此,我们需要能准确定量血清HBsAg和HBeAg水平的检测方法。目前,有两种试剂可以定量检测血清HBsAg水平,分别是美国雅培公司和德国罗氏公司的HBsAg检测方法。其中最为广泛使用的是雅培表面抗原检测方法。而罗氏表面抗原检测方法可以通过简单的稀释步骤和转换实现HBsAg定量检测。Karsten Wursthorn和Milan J. Sonneveld等研究团队已经对两种检测方法进行比较,发现二者之间的结果具有很高的相关性。但是其研究病例基因型分布以A型和D型为主,而我国分布主要是C型和B型,故本研究第一部分比较雅培和罗氏HBsAg检测方法定量检测基因型B和C患者血清HBsAg水平的相关性和差异性。目前国际上尚无HBeAg定量检测试剂,但是雅培和罗氏HBeAg检测方法都可以通过PEIU标准品,制作标准曲线,然后实现定量检测血清HBeAg水平。雅培E抗原试剂每次更换批号时,需要重新制作标准曲线；而罗氏HBeAg试剂可以直接使用由公司提供的定量转换公式,不受试剂批号影响。第二部分主要比较雅培和罗氏HBeAg检测方法定量检测结果的一致性。乙肝病毒C基因区高度易变,常见变异位点G1896A变异和A1762T/G1764A双变异。前者可使HBeAg翻译提前终止,而A1762T/G1764A双变异可明显降低血清HBeAg水平。而血清HBeAg (?)氏水平者易于发生血清学转换。但是临床实践中,我们亦观察到部分病例持续维持低水平E抗原,而不发生E抗原血清学转换。我们推测,是否造成HBeAg定量降低的原因的差异,导致其结果的不同。因此,第三部分研究主要着重结合BCP/PC变异,观察E抗原定量水平对血清学转换发生率的影响,从而提高HBeAg定量水平对抗病毒治疗疗效的评估预测能力。研究目的：1.结合基因型及抗病毒治疗状态,比较罗氏与雅培试剂定量检测乙肝E抗原阳性患者血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性。2.结合BCP/PC变异,观察血清HBeAg定量水平对HBeAg血清学转换发生率的影响,从而提高HBeAg定量水平对抗病毒治疗疗效的评估预测能力。研究方法：1.比较雅培和罗氏试剂检测血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性1.1研究样本来源共收集1308例乙肝患者病例血清,均来自广州市南方医院肝病中心。所有血清均同时接受雅培和罗氏两种表面抗原和E抗原方法检测,其中16份血清未纳入定量分析比较,因两种或一种方法检测其E抗原为阴性。所有血清检测前均被分装为成两份,保存于-30℃冰箱。1.2雅培和罗氏检验方法1.2.1HBsAg检测方法雅培HBsAg方法是化学发光微粒法,罗氏方法是电子化学发光微粒法。前者是直接定量检测方法,而罗氏HBsAg方法需要通过简单的稀释步骤和转换实现定量检测血清HBsAg水平。1.2.2HBeAg检测方法雅培和罗氏HBeAg方法都是定性检测方法,但是通过PEIU标准品制作标准曲线来定量检测血清HBeAg水平。1.3基因型测定对与乙肝病毒聚合酶逆转录区BC亚区部分重叠的表面抗原编码区进行直接测序,然后进行系统树构建分型。1.4统计分析所有结果在分析前均取10为底的对数值,两种方法的相关性比较使用SPSS18.0统计软件进行Pearson相关分析；连续变量的分组比较采用非参数方法Mann-Whitney;两种方法差异性分析采用Graphpad prism5.0软件Bland-Altmanplot进行描述。所有分析均采用双侧检验,若P<0.05,则认为有统计学意义。2. HBeAg定量与BCP/PC变异及其血清学转换关系研究2.1病例来源患者来自南方医院肝病中心参加“国家十一五重大专项”EFFORT临床研究的受试者共83例。2.2基因变异分析用DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取血清HBV DNA,巢氏PCR扩增C基因区并将第二轮产物送英骏公司进行直接测序。序列峰图用Chromas软件分析,变异判断用Mutation surveyor软件3.0分析。2.3统计分析所有数据均使用SPSS18.0统计软件进行分析。分组间比较采用非参数Mann-Whitney方法分析,多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验,率的比较用Fisher精确检验分析,所有结果均采用双侧检验,P<0.05被认为差异有统计学意义。HBV DNA和HBeAg在分析前取10为底的对数值。研究结果：1.比较雅培和罗氏试剂检测血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性1.1基因型分布与治疗状态根据直接测序及种系发生分析,血清总体基因型分布为：B基因型组：514例(39.78%)；C基因型组776例(60.06%),D基因型2例(0.16%)。核苷初治组基因型分布为：B基因型442例(39.46%)；C基因型676例(60.36%),D基因型2例(0.18%)。根据治疗状态,分别有1120(86.69%)份未治疗患者血清纳入初治组,172(13.31%)血清纳入治疗组。1.2治疗前血清HBsAg和HBeAg水平与基因分布关系治疗前表面抗原分布因基因型不同而有显著差异,基因型B组表面抗原定量高于基因型C组(中位数B:C：4.53vs4.0810g10IU/mL,P=0.000,Z=-10.845)；治疗前样本不同基因型E抗原定量的差异无统计学意义(中位数B:C：2.96vs2.88log10PEI U/mL,P=0.203,Z=-1.274)。1.3系统性比较雅培和罗氏HBsAg方法系统性比较,其相关系数是0.939(95%C1：0.932～0.945),P=0.000。而其差异性为：log1o IU/mL[罗氏]-log1o IU/mL[雅培]=0.075±0.241log1o IU/mL。而两种检测方法定量检测HBeAg水平系统性比较,其相关系数是0.987(95%CI：0.985～0.988),P=0.000。而其差异性为：log1o PEIU/ml[罗氏]-1og10PE IU/ml[雅培])=-0.149±0.165loglo PE IU/ml。1.4基因型分组比较根据基因型分成基因型B组和C组,两种HBsAg检测方法相关系数分别为0.942(95%CI：0.932～0.951)和0.948(95%CI：0.940～0.955),P=0.000。而其差异性(比率(罗氏/雅培))分别为0.993和1.037。两种HBeAg检测方法其相关系数分别为0.988(95%CI：0.985～0.990)和0.986(95%CI：0.984～0.988),P=0.000。而其差异性(比率(罗氏/雅培))分别为0.815和0.957。1.5治疗状态分组比较根据治疗状态,各基因型组分别被分为两组,B基因型组治疗前HBsAg相关性为0.919(95%CI：0.903～0.932),治疗后相关性为0.979(95%CI：0.9670.987,),P=0.000。而C基因型组治疗前HBsAg相关性为0.945(95%CI：0.936～0.952)；治疗后相关性0.956(95%CI：0.935～0.970),P=0.000。B基因型组治疗前HBeAg相关性为0.985(95%CI：0.981～0.987；治疗后HBeAg相关性为0.980(95%CI：0.968～0.988,P=0.000。而C基因型组治疗前HBeAg相关性为0.984(95%CI：0.981～0.986)；治疗后HBeAg相关性0.982(95%CI：0.973～0.988),P=0.000。2.HBeAg定量与BCP/PC变异及其血清学转换关系研究2.1治疗52周累积HBeAg血清学转换率与基线期HBeAg定量关系根据HBeAg水平是否大于2.44log10PEIU/ml,分为HBeAg (?)氐定量组和HBeAg高定量组,其随访12周、24周、36周、52周时HBeAg血清学转换率为23.53%VS0%(P=0.003),35.29%VS1.92%(P=0.001),41.18%VS5.77%(P=0.001),52.94%VS17.31%(P=0.009)。2.2BCP/PC变异与基线期E抗原定量关系研究变异组与野生株组E抗原定量水平有区别,有统计学意义(中位数变异组：野生组：2.69VS3.12log10PEI U/ml, P=0.032)；以HBV DNA校正后,同样有统计学意义(P=0.003)。1762A/1764T纯合变异者E抗原定量中位数为2.11logloPEIU/ml,杂合变异者E抗原定量中位数为3.101ogloPEI U/ml,野生株E抗原定量中位数为3.081og1o PEI U/ml,三组之间E抗原定量有统计学意义差别(P=0.002)。而杂合变异组与野生组之间差别无统计学意义(P=0.693)。以HBV DNA水平作为校正因素,比较三组间区别,同样有统计学意义(P=0.006),而杂合变异组与野生组之间无统计学意义(P=0.973)。2.3BCP/PC变异与治疗各期E抗原血清学转换率关系研究变异组与野生组随访12周、24周、36周、52周时HBeAg血清学转换率为9.5%VS0.0%(P=0.150),9.5%VS11.1%(P=1.00),9.5%VS22.2%(P=0.173),23.8%VS29.6%(P=0.589)。研究结论：1.雅培与罗氏HBsAg方法和HBeAg方法定量检测结果均具有较高的相关性和低差异性,且不受治疗状态和基因型影响。两种检测方法均可用于临床与科研定量检测HBsAg和HBeAg水平。2.G1896A和/或A1762T/G1764A变异可明显降低血清HBeAg水平。3.血清HBeAg低定量水平时,发生HBeAg血清学转换的概率更高。4.治疗前G1896A和/或A1762T/G1764A变异与否与HBeAg血清学转换率无明显相关性。