灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:(一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH 7.4和pH 5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1:1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。(二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1:1。2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH 7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH 3.0,最少的为pH 5.0;设定pH 7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1:1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。