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背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症损伤性疾病,具有变性、渗出和增生等经典炎症的特征,是导致ACI发生的重要危险因素,其中淋巴细胞发挥重要的免疫效应。尤其是固有免疫和适应性免疫反应,在动脉粥样硬化形成中至关重要。大量研究表明,炎症反应存在于动脉粥样硬化病变的各个阶段,致动脉粥样硬化因子可能是通过导致炎症反应来引起动脉粥样硬化的发生。急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)是由各种原因导致的血管堵塞,导致大脑供血中断,缺血引起脑组织的坏死,大多有动脉粥样硬化和斑块破裂的病理基础,严重可致死。ACI是常见的心血管疾病,在世界范围有着高发病率,高残疾率,高死亡率特征的疾病,对人体健康构成严重威胁。该病症多见于老年群体,伴随着我国老龄化过程的加快,急性脑梗死的发病率增高。主要有炎性物质的释放和淋巴细胞的激活导致的局部炎症、以及缺氧缺血导致的脑细胞水肿、细胞凋亡等病理生理改变。动脉粥样硬化是急性脑梗塞发生的主要原因之一。氧化型低密度脂蛋白(oxidized-low density lipoprotein,ox-LDL)可损伤内皮细胞本身,促进巨噬细胞黏附聚集于内膜下,摄取ox-LDL形成泡沫细胞,沉积在内膜下,导致动脉粥样硬化病程的发生。内膜下脂质代谢紊乱是导致动脉粥样硬化的重要环节,也是AS的早期病理特征。固有淋巴细胞(Innate lymphoid cells,ILCs)是一种新发现的异质性淋巴细胞亚群,在组织稳态和病理性炎症中起重要作用。依据杀伤能力强弱,ILCs可分为“细胞毒性”ILCs[自然杀伤细胞(conventional natural killer,cNK)]或“辅助”ILCs(ILC1,ILC2和ILC3)。还有一种分法是依据它们的关键转录因子的表达和细胞因子的产生,ILCs被分成三个淋巴样细胞亚群:第1组ILCs包含NK细胞和ILC1,第2组ILCs包含ILC2,第3组ILCs包括淋巴组织诱导(lymphoid tissue inducer,LTi)细胞和ILC3。有研究提出ILCs是辅助性T细胞Th1、Th2和Th17的“镜像细胞”,但是与辅助性T细胞比较,ILCs缺乏识别其他淋巴细胞的细胞表面分子,不能识别任何抗原。ILCs在免疫应答的持续反应过程中发挥更复杂的作用,参与从固有免疫到获得性免疫的转变,并且促成慢性炎症。ILCs与Th1、Th2、Th17等互为“镜像细胞”,在抵抗病原体和免疫炎症性疾病的保护性免疫中起重要作用,Th1、Th2、Th17等在动脉粥样硬化中已有不少报道,然而,ILCs在ACI中的表现和作用是未知的。氧化型低密度脂蛋白是AS发生和发展的关键因素,并通过多种机制导致内皮功能障碍和斑块失稳。氧化型低密度脂蛋白是否对ILCs有直接的影响也尚不清楚。因此,本研究通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测健康人和ACI患者外周血ILCs的表达变化,通过细胞实验研究ox-LDL对ILCs的表达变化的影响,初步探讨ACI发生中ILCs失衡的机制。并目的:检测ACI患者外周血ILCs亚群表达变化,分析ILCs亚群失衡情况。初步探讨ACI发生中ILCs失衡的机制。方法:(1)本研究以健康人(60例)和初诊动脉粥样硬化硬化性脑梗死患者(63例)为研究对象,通过多参数流式细胞术鉴定ILCs并检测不同人群外周血ILCs细胞表达率;并分析不同人群ILC1s、ILC2s和ILC3s的表达情况;通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immune-sorbent assay,ELISA)检测不同人群ox-LDL的血清浓度,并分析ox-LDL,低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C),同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy),脂蛋白a[lipoprotein(a),Lp(a)],C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)血清浓度与ILC1和ILC2细胞表达率和ILC1/ILC2比值的相关性。逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测不同人群外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中诱导ILCs生成的关键细胞因子IL-18、IL-23、IL-33表达水平;(2)ox-LDL体外诱导PBMCs。不同浓度的ox-LDL和正常对照组的PBMCs体外共同培养24h。FCM检测ILCs的表达率,分析不同浓度ox-LDL对ILCs数量变化的影响;选取诱导ILCs变化最明显的ox-LDL浓度,与ACI患者组和正常对照组PBMCs体外共同培养24h。FCM检测ILCs的表达率,分析各组ILCs的表达变化。结果:(1)各组数据基本资料和血脂结果显示:与对照组比较,ACI患者组空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。另外,ACI患者组总胆固醇(total cholesterol,TC)、LDL-C明显高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。(2)流式细胞术在人外周血中鉴定ILC1,ILC2和ILC3:根据CD294(CRTH2)和CD117的表达,CD127~+ILC可分为三个亚组:ILC1(CD117~–CD161~+CD294~–),ILC2(CD294~+)和ILC3(CD294~–CD117~+)细胞。(3)ACI患者外周血ILC2细胞表达减弱和ILC1细胞表达增强:ACI患者外周ILC1细胞表达率(40.58±8.10%)显着高于对照组(20.12±8.44%),差异有统计学意义(P<0.01)。ACI患者外周ILC2细胞表达率(23.34±6.12%)显着低于对照组(41.78±11.11%)差异有统计学意义(P<0.01)。另外,在ACI患者(28.11±8.80%)和对照组(24.95±10.06%)之间的ILC3细胞表达率无显着差异(P>0.05)。此外,ACI患者ILC1/ILC2比值(1.72±0.35)显着高于对照组(0.58±0.24),差异有统计学意义(P<0.01)。(4)ACI患者血清ox-LDL、LDL-C及炎症标志物浓度升高:与对照组比较,ACI患者组ox-LDL,LDL-C、Hcy,Lp(a)和CRP浓度显着升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。(5)LC1和ILC2细胞表达率和ILC1/ILC2比值与ox-LDL,LDL-C和炎症标志物浓度相关:数据显示,ILC1细胞表达率与血清中ox-LDL,LDL-C,Hcy,Lp(a)和CRP浓度呈正相关(分别为r=0.894,0.467,0.672,0.561和0.643,P<0.01),而ILC1细胞表达率与血清中ox-LDL,LDL-C,Hcy,Lp(a)和CRP浓度呈负相关(分别为r=–0.663,–0.548,–0.606,–0.497,和–0.514,P<0.01)。此外,ILC1/ILC2比值也与ox-LDL,LDL-C,Hcy,Lp(a)和CRP浓度呈正相关(分别为r=0.828,0.321,0.664,0.439,和0.649,P<0.01)。(6)ACI患者PBMCs细胞中IL-18、IL-33和IL-23的表达:ACI患者IL-18 mRNA水平显著高于对照组(P<0.01),IL-33mRNA水平显著低于对照组(P<0.01),而ACI与对照组在IL-23 mRNA水平无显著差异(P>0.05,各组n=10)。(7)ox-LDL诱导实验:研究发现随着ox-LDL浓度的增加,ILC2细胞表达率降低,而ILC1细胞表达率升高。ILC3细胞表达率未见明显改变ox-LDL浓度为10μg/mL时ILCs变化最显著。10μg/mLox-LDL与ACI患者组和正常对照组PBMCs体外共同培养24h,结果表明在ACI患者组和对照组中皆出现ILC2s细胞表达率降低和ILC1s细胞表达率增加,ACI患者组中ILC2s降低约39.2%,ILC1s增加约41.7%,而正常对照组中ILC2s降低约19.3%,ILC1s增加约28.7%,表明与对照组比较,ACI患者组ILC1s和ILC2s变化程度更为显著,对ox-LDL刺激效应更为敏感。同时,两组的CD45+Lin–CD127+ILC细胞数量无明显差异。结论:(1)ACI患者外周ILC1表达升高,ILC2表达减低。关键细胞因子的变化趋势与ILCs亚群的变化高度一致。ILC1水平与ox-LDL及HCY等炎症标志物呈显著正相关,而ILC2水平则与上述指标均呈显著负相关。ILC亚群有可能成为ACI早期诊断及预后判断的敏感新指标。(2)促AS重要因子ox-LDL ox-LDL可上调ILC1表达,下调ILC2表达,引起ILC失衡。且具有浓度依赖性。ox-LDL对ACI患者ILC1/ILC2表达水平影响更为显著。综上所述,ACI患者存在外周ILC失衡。ILC1和ILC2表达水平可成为ACI早期诊断和动态监测的敏感指标。ox-LDL可直接影响ILC1/ILC2平衡,使平衡向ILC2偏移,进而引起ACI发生。