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背景骨关节炎（OA）是一种好发于中老年人的慢性骨关节疾病,其主要特征为关节软骨退行性变和关节炎症,临床上以慢性疼痛和关节活动障碍为主要表现,逐年加重,最终严重影响生活质量。OA的发病机制复杂,其病因尚不清楚。目前,OA的发生被认为与各种风险因素有关,包括机械、遗传和物理因素。在临床实践中,OA只能缓解和改善,但不能完全治愈,目前常规保留关节治疗的临床效果较差,副作用的风险较高。因此,阐明骨性关节炎的病理机制可能有助于寻找新的特异性生物标志物,从而有助于开发控制骨性关节炎症状的有效治疗方法。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子,由共价连接形成的3’和5’磷酸二酯键组成环状结构,表达稳定且抵抗RNA外切酶介导的降解。此外,环状RNA在体液中高度稳定和敏感,可用于生化测试。在功能上,circRNA可吸附微小RNA（miRNA）,作为分子海绵与miRNA结合,影响相应的信使RNA（m RNA）,并最终调节靶基因的表达。已有研究表明,CircRNA参与OA的发生和发展,表明它们可能作为OA的前瞻性诊断标志物和治疗靶点。最近,circRNA作为microRNA（miRNA）海绵的机理研究已成为RNA研究领域的一个日益增长的兴趣,这表明circRNA通过强有力地结合和抑制miRNA转录进而影响下游m RNA表达,参与各种疾病。通过生信分析技术和微阵列技术,我们可以通过临床标本寻找OA患者的关节软骨细胞与正常关节软骨细胞之间的差异化基因,从而研究差异化表达的circRNA在OA中的作用机制。目的研究环状RNA（circRNA）hsacirc0134111（circPDE1C）在OA中的表达及其在OA中介导软骨细胞降解和凋亡的作用,探究其参与调控的潜在分子机制。方法1.我们收集了安徽医科大学第一附属医院49例OA患者的膝关节的软骨组织、以及13例截肢患者的软骨组织,对收集到的临床样本进行Safranin O/Fast Green染色与组织学评分,同时进行高通量测序及微阵列分析寻找差异表达的circRNA,研究表达差异前5的circRNA在49例OA患者以及13例截肢患者的软骨组织中的表达水平,以及circRNA的表达水平与OA患者的Mankin评分的相关性,确定hsacirc0134111（circPDE1C）为接下来的研究对象,然后建立大鼠OA模型来进行体内研究,实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,RT-q PCR）检测大鼠软骨组织中circPDE1C的表达水平;最后通过IL-1β处理CHON001细胞构建模拟OA软骨细胞的体外模型,通过慢病毒转染来改变CHON-001细胞中circPDE1C的表达,检测转染后各组软骨降解标志物及凋亡标志物的表达,流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡,来验证circPDE1C介导软骨细胞降解和凋亡的调控。最后用Fish技术研究circPDE1C在软骨细胞中的定位。2.利用生信分析技术,通过circ Bank（http://www.circbank.cn/）和RNA Hybrid网站（http://alk.ibms.sinica.edu.tw/cgi-bin/RNAhybrid/RNAhybrid.cgi）预测circPDE1C的下游microRNA及m RNA,并从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载microRNA表达芯片GSE105027与m RNA表达芯片GSE117999,通过设定Log FC＞1 or 2,adj P value＜0.05作为筛选阈值,筛选出OA中差异表达的microRNA与m RNA,将两者结果结合筛选出可能的下游基因。利用RNA下拉技术确定circPDE1C能结合的miRNA,再用RT-q PCR确认筛选出的microRNA与m RNA在OA软骨组织中的表达以及其表达与患者Mankin Scores的相关性,以此来确定circPDE1C的下游microRNA与m RNA。最后,通过基因集富集分析（GSEA）分析GSE117999微阵列中差异表达基因富集的信号通路。3.用双荧光素酶报告实验确认miR-224-5p与circPDE1C的结合关系以及miR-224-5p与CCL2的结合关系,将miR-224 inhibitor转染到circPDE1C低表达的CHON-001细胞中,将miR-224转染到circPDE1C过表达的CHON-001细胞中,检测IL-1β处理以及circPDE1C的表达对miR-224-5p表达的影响,以及miR-224和circPDE1C的表达对CCL2表达的影响,RT-q PCR检测miR-224-5p的表达对circPDE1C在IL-1β诱导的软骨细胞的降解和凋亡的影响。最后,研究CCL2的表达对JAK2和STAT3磷酸化的影响,同时用免疫荧光检测各组转染后的CHON-001细胞中phos-STAT3的入核比例。结果1.通过对临床收集的标本进行微阵列分析,寻找到差异circRNA,与截肢患者相比,circPDE1C在OA患者的膝关节软骨组织中显著过度表达（P＜0.05）,且其表达水平与Mankin评分正相关。同时动物试验发现circPDE1C在OA大鼠的软骨组织中也是显著过表达的。利用IL-1β诱导CHON001细胞成功构建OA软骨细胞的体外模型,并分别在CHON-001细胞中过度表达或敲低circPDE1C的表达。随后,我们使用阿尔辛蓝和甲苯胺蓝染色,发现在抑制circPDE1C表达后,细胞中的糖胺聚糖含量显著增加。此外,抑制circPDE1C表达后可抑制细胞外基质的降解和软骨细胞的凋亡,然而,在过度表达circPDE1C的细胞中观察到了完全相反的结果。2.我们利用生信分析的方法,通过circ Bank和RNA Hybrid网站预测的结果与GSE105027中下调的miRNA相结合,我们筛选了八个miRNA。然后,我们使用生物素化标记的circPDE1C探针进行RNA下拉分析,发现三种miRNA（miR-103a-3p、miR-224-5p和miR-320-3p）之间存在显著差异。随后,我们进一步分析了miR-103a-3p、miR-224-5p和miR-320-3p在OA患者中的表达。其在OA患者中的表达均远低于非OA受试者。然而,miR-224-5p的表达与OA患者的Mankin评分具有最高的相关性。同样的方法我们找到了下游的可能的m RNA CCL2和可能的信号通路JAK/STAT。3.在联合转染miR-224和circPDE1C-wt的细胞中,以及miR-224和CCL2-wt的细胞中,荧光素酶活性显著下降,证实相互之间的靶向关系。体外细胞实验结果显示,circPDE1C可以靶向miR-224-5p,而miR-224-5p在OA患者膝关节软骨组织中表达较差,miR-224-5p的过度表达可抑制软骨细胞的降解和凋亡。miR-224-5p还靶向CCL2,CCL2激活JAK2/STAT信号通路,从而促进软骨降解和凋亡。结论circPDE1C通过直接与miR-224-5p/CCL2信号相互作用,以及通过激活JAK/STAT3通路间接参与调控软骨细胞降解和凋亡。因此,本研究表明,circPDE1C是维持软骨细胞表型的关键调节剂。然而,骨性关节炎仍然是一种多因素疾病,需要更多的研究来探索其他可能的分子机制。