【摘 要】
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目的:类风湿性关节炎（RA）是一种全身性的自身免疫疾病,可诱发严重的滑膜炎,进而侵犯邻近关节结构,造成软骨损伤、骨侵蚀,最终导致关节畸形,影响关节功能的发挥。其发病与CD4+T细胞亚群密切相关,主要涉及Th1、Th17、Treg细胞,其中Th17细胞的作用日益受到重视,被认为是滑膜破骨细胞形成的关键因素,Th17分泌的IL-17在关节炎症和破坏中起决定作用。本研究旨在探究人齿龈间充质干细胞的外泌体
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（No.2017YFA0105802）； 国家自然科学基金项目（No.31600793&81571832）；
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目的:类风湿性关节炎（RA）是一种全身性的自身免疫疾病,可诱发严重的滑膜炎,进而侵犯邻近关节结构,造成软骨损伤、骨侵蚀,最终导致关节畸形,影响关节功能的发挥。其发病与CD4+T细胞亚群密切相关,主要涉及Th1、Th17、Treg细胞,其中Th17细胞的作用日益受到重视,被认为是滑膜破骨细胞形成的关键因素,Th17分泌的IL-17在关节炎症和破坏中起决定作用。本研究旨在探究人齿龈间充质干细胞的外泌体（GMSC-EXO）对RA的小鼠模型——胶原诱导关节炎模型（CIA）是否有治疗效果,并从CD4+T细胞及IL-17相关的信号通路角度探究其潜在治疗机制。方法:本研究可分为体内实验和体外实验两部分。体内实验:使用DBA/1J小鼠构建CIA模型,设置PBS组、GMSC组、GMSC-EXO组,适时给予相应的治疗,观察并记录炎症发展过程中小鼠足爪厚度、关节炎评分及体重变化;56天后取材,Micro-CT扫描足爪,检测关节的骨侵蚀情况;Western Blot检测足爪中炎症相关蛋白（IL-17RA、Act1、TRAF6、p65、p50）表达,探究GMSC-EXO能否通过IL-17RA-NF-κB信号通路发挥免疫抑制作用;足爪切片HE染色观察病理学变化;足爪免疫组化检测炎性蛋白定位及强度;流式细胞术检测脾及淋巴结细胞中CD4+T细胞亚群（Th1、Th17、Treg）比例变化;ELISA检测血清中炎症相关细胞因子（IFN-γ、IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α）水平的变化。体外实验:通过直接共培养的方法探究GMSC-EXO对CD4+T细胞亚群（Th1、Th17、Tr1）比例的影响,并通过ELISA检测培养上清中IFN-γ、IL-17A、IL-10水平的变化。结果:体内实验数据显示,与PBS组比较,GMSC-EXO组和GMSC组对CIA均有明显的改善作用,足爪骨侵蚀状况明显减轻,足爪蛋白中IL-17RA-NF-κB通路信号蛋白IL-17RA、Act1、TRAF6、p65、p50均下调,HE染色观察到关节滑膜处炎性细胞浸润情况明显改善,免疫组化显示炎性蛋白分布范围明显减小;脾及淋巴结中促炎性Th1、Th17细胞比例降低,而负向调节的Treg细胞比例升高;血清中发挥促炎作用的IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-6因子水平下降,发挥抑炎作用的IL-10水平升高。体外实验数据显示,CD4+T细胞亚群与GMSC及GMSC-EXO共培养后,CD4+T细胞增殖增加;Tr1亚群的比例存在GMSC-EXO剂量依赖性,随GMSC-EXO剂量的增加而上升;GMSC-EXO和GMSC均可显著抑制Th1和Th17亚群的比例。ELISA检测结果显示,经GMSC-EXO和GMSC处理后,IL-10水平显著上调（与Tr1亚群变化趋势一致）;IFN-γ和IL-17A水平显著下调,且随着GMSC-EXO剂量的增加,IL-17A水平呈剂量依赖性下降,而IFN-γ则没有。结论:1.GMSC-EXO与GMSC具有相似的免疫调节作用,均能有效改善CIA;2.GMSC-EXO可通过抑制Th1、Th17分化,促进Treg分化缓解炎症;3.GMSC-EXO可通过抑制IL-17RA-NF-κB通路缓解炎症,减少骨侵蚀等;综上所述,GMSC-EXO可通过调节CD4+T细胞亚群及抑制IL-17RA-NF-κB通路改善CIA。
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