奶牛乳房炎是造成奶牛饲养行业经济损失的重要原因之一。经过多年的认识和研究,已经建立起来了比较完备的预防和控制体系;但是,在畜牧业相对落后的发展中国家,由于疾病防控理论和实践相对落后,该病造成的经济损失依然非常严重。减少和杜绝奶牛乳房炎的发生,对于提高牛群健康状态、保障和提高动物福利,对于提升乳制品的安全性和质量都是非常必要的。因此,开发一种能够普遍应用于奶牛的疫苗就显得尤为重要,而基因工程重组疫苗,是达成此目的的最有前景的研究方向之一。由于奶牛乳房炎病因复杂、病原种类繁多且具有很强的地域分布特性,单一菌株疫苗对于特定的牛群能够取得较好的预防效果,但对于不同地区病原种类不同的牛群,不但免疫过程费时费力、难以取得满意的预防效果,还会因为注射疫苗时的应激反应而影响牛群的产奶量。简单地将多种病原灭活混合,则容易导致免疫剂量过大而炎症反应严重,或是抗原含量不足,免疫效果不够理想的僵局。而基因工程亚单位疫苗的出现,使得这一看似无从下手的难题有了新的希望:针对病原种类较多的事实,可以考虑重点选择同一病原的几个关键性的保护性抗原,进而将多种病原的保护性抗原组合在一起,最终以一种多价、多联重组亚单位疫苗的形式出现,有望解决免疫剂量过大的难题,也可以解决由于抗原量不足而难以诱导产生有效的保护力的问题。本研究将传统的生化鉴定与分子生物学技术鉴定相结合,对甘肃及周边地区采集的乳房炎乳样进行病原菌的分离和鉴定;通过分子生物学技术,分析分离菌株的毒力基因和抗药基因的频率分布;采用微量肉汤稀释法分析分离菌株对临床常用抗生素的敏感情况;应用基因工程技术,构建分离菌株的真核表达载体;经转染人乳腺癌细胞表达及蛋白纯化后,对Balb/c小鼠进行免疫和攻毒试验,评价重组ClfA蛋白疫苗和DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护效果。对甘肃及周边地区采集的380份乳样进行病原分离鉴定,主要得到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)45株、肠球菌(Enterococcus spp.)60株、大肠杆菌(Escherichia coli)13株、哈弗尼亚细菌(Hafnia)9株、链球菌(Streptococcus spp.)8株。采用微量肉汤稀释法,分析金黄色葡萄球菌对10种常用抗生素的耐药情况;其中,高于80%的金黄色葡萄球菌对环丙沙星、庆大霉素、卡那霉素和氯霉素均保持敏感,而对青霉素、氨苄西林、万古霉素具有了耐受性,此外,42%的菌株对对四环素具有耐受性。肠球菌对青霉素普遍耐受,有50%肠球菌和22%的肠球菌能够耐受高浓度的庆大霉素(500μg/ml)和链霉素(1000μg/ml),绝大部分菌株对氨苄青霉素、万古霉素和四环素敏感;分离获得的大肠杆菌中对四环素的耐受程度较高(6/13),对其余测试的抗生素基本保持敏感。采用PCR技术筛选金黄色葡萄球菌毒力基因携带情况,其中,金黄色葡萄球菌对ClfA、FnbA、hlb、hld、hlg、seb检出率较高,检出率依次为91%、88%、94%、91%、76%和64%;agr、lukS/E/M、hla、edin、eta、etb、tst和sea/c/d/e/g/i/j/n/o/m均未检测到。成功构建了金黄色葡萄球菌ClfA-pcDNA 3.1 V5-His B、肠球菌esp-pcDNA3.1 V5-His B、大肠杆菌LPS-pcDNA 3.1 V5-His B和金黄色葡萄球菌hlb-pcDNA3.1 V5-His B 4个真核表达载体。重组ClfA表达载体在MCF-7细胞中成功表达,经western blotting验证具有与天然蛋白产物相似的抗原特性。动物免疫保护试验中,重组ClfA蛋白免疫组小鼠的白细胞介素、免疫球蛋白和干扰素水平均显著高于对照组,表明重组蛋白能够给受免疫动物提供足够的保护力,符合良好的疫苗靶标特性,具有进一步开发应用的潜力。上述研究从实际出发,为深入研究和开发奶牛乳房炎病原菌多价、多联基因工程重组亚单位疫苗提供理论和实践材料。