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研究背景和目的牙周病最普遍临床表现为导致牙周支持组织的破坏及骨再生困难,近年来,骨组织工程学在牙周病学治疗方面得到广泛应用研究,因此促进骨再生方面细胞增殖、迁移及成骨是提高该类疾病治愈率的关键。小鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Cell Line,ST2)是一种多能干细胞,取自源于小鼠体内,研究证明其拥有来源广泛并在一定条件下具有成脂、成骨、成软骨细胞能力的特点,因此作为基础研究中优秀的种子细胞也广为应用在组织工程技术方面及原位组织工程技术。碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,bFGF)及基质细胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)在牙周组织再生及骨再生领域已得到广泛研究。在转化医学方面,目前种子细胞及生长因子依然在很多方面受限,而原位组织工程技术(in situ engineering technique)的发展可以通过募集干细胞作用的各类生长因子有效地解决这一个问题。碱性成纤维细胞生长因子及基质细胞衍生因子是近年来的明星生长因子,得到了学术界的广泛关注。很多体内实验研究已证实,bFGF能够促进细胞增殖及其成骨且效果明显。SDF-1则是经典的趋化因子,对免疫、循环及中枢系统的发育有着关键作用,且SDF-1在受伤组织(心脏、肾、大脑、皮肤及骨髓)中高表达,其表达的提高被认为是促进干细胞和前体细胞迁移进行组织修复再生的重要信号。但是对于二者对于ST2细胞增殖迁移的差异并无相关研究,其细胞机制也不清楚。各种细胞的增殖迁移涉及多条信号转导通路的调节,目前研究较多并得到相关文献资料验证支持的是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase,MAPK)家族外加PI3K/AKT信号通路,其对于细胞增殖、生长、分化、凋亡等生理现象均有显著作用。本实验的目的在于为内源性干细胞归巢理论提供依据,bFGF与SDF-1分别处理ST2细胞探究其增殖迁移方面的差异,为组织工程技术选择一种更为优质的生长因子,并探讨bFGF如何发挥其作用机制及相关信号通路,以及丝裂素活化蛋白激酶家族MAPK及PI3K/AKT是否在细胞增殖迁移中扮演重要的角色且孰轻孰重。材料和方法ST2细胞购自日本Riken Cell Bank,采用体外培养ST2,进行细胞的复苏、冻存、传代及培养等操作。细胞培养传代,倒置相差显微镜下观察,细胞生长状态形态良好,繁殖能力强,即达到实验要求。1、将ST2细胞分为2组,分别为bFGF实验组,SDF-1实验组,相关文献参考,bFGF实验组因子浓度分别设置为0(对照组浓度)、10、20、40、80、100ng/ml,SDF-1实验组因子浓度分别设置为0(对照组浓度)、50、100、200、400 ng/ml,分别置于无菌培养箱内培养24、48、72h,通过CellConting Kit-8(CCK8)试剂盒检测不同浓度两种生长因子对于细胞增殖的影响,获得增殖ST2细胞的最佳生长因子浓度。2、实验共分为三组:空白对照组,bFGF组(20ng/ml),SDF-1组(200ng/ml),采用CCK8方法检测不同浓度两种因子在24h,48h时间对骨髓基质细胞增殖的影响。3、实验共分为三组:空白对照组,bFGF 组(20ng/ml),SDF-1 组(200ng/ml),通过 transwell小室法检测不同浓度两种因子对骨髓基质细胞趋化的影响。4、实验采用蛋白质免疫印迹实验(western blot)技术,分为用20 ng/mlbFGF刺激培养骨髓基质细胞0、5、10、15、30、60、120 min,根据时间进行分组,观察ST2细胞对于AKT/P-AKT、Erk/P-Erk蛋白相对表达含量的变化。5、实验采用western blot技术,分别单独加入PI3K/AKT抑制剂LY294002,Erk抑制剂U0126+bFGF(10 ng/ml)组对ST2细胞进行活化,检测各通路磷酸化蛋白的表达变化。6、实验分为两组:抑制剂LY294002组及抑制剂U0126组,每组又分为单独抑制剂组、抑制剂+bFGF组,采用CCK8技术检测细胞增殖情况变化,transwell小室法及划痕实验检测细胞迁移变化。结果:1、与空白对照组相比,24h时bFGF实验组在浓度为10、20、40、80 ng/ml时对于骨髓基质细胞系增殖有促进作用(p<0.05),相反地在bFGF浓度为100 ng/ml时,表现为高浓度抑制作用(p<0.05),且最佳浓度为20ng/ml。SDF-1实验组在浓度为50、100ng/ml对ST2细胞增殖有效果,浓度为200ng/ml可有效促进细胞增殖最佳(p<0.05),相反地浓度为400ng/ml时对ST2细胞增殖表现出高浓度抑制(p<0.05),且最佳浓度为200ng/ml。2、经CCK8细胞增殖实验显示:与空白对照组相比,在24、48、72h时间,20 ng/ml bFGF 和 200 ng/ml SDF-1 均能促进 ST2 细胞增殖(p＜0.01),同时,20 ng/ml bFGF组较之于200ng/mlSDF-1组效果更为显著(p<0.01)。3、经transwell小室法检测,与空白对照组相比,20 ng/ml bFGF和200 ng/ml SDF-1对小鼠骨髓基质细胞系ST2均有迁移趋化作用(p<0.01),且bFGF的迁移趋化作用较SDF-1更为明显(p<0.01)。4、相同剂量的20 ng/ml bFGF刺激ST2细胞后,随着作用时间的延长,磷酸化AKT、Erk的表达逐渐升高,分别在30min、15min时磷酸化AKT、Erk表达到顶峰,随后磷酸化逐渐降低。5、给予ST2细胞关于PI3K/AKT、MAPK相关通路Erk特异性阻断剂进行处理,经Western Blot测定验证,与空白对照组相比,单独抑制剂组磷酸化蛋白表达含量降低,抑制剂预处理后加生长因子组相关蛋白磷酸化较空白组升高但与单独生长因子组比较含量降低。6、将PI3K/AKT,MAPK相关通路Erk特异性阻断剂LY294002及U0126对ST2细胞进行处理,CCK8细胞增殖实验,transwell小室及细胞划痕实验均可同等证明PI3K/AKT通路能更好的阻断细胞的增殖与迁移,加入bFGF生长因子细胞生理状况不会有明显改善,但是MAPK/Erk通路可后续被bFGF生长因子再次激活,促进细胞的增殖、迁移。结论bFGF和SDF-1处理ST2细胞后,细胞增殖迁移确有增强,最佳有效浓度分别为 20 ng/ml 和 200 ng/ml,且 20 ng/ml bFGF 增殖迁移效果优于 200 ng/ml SDF-1。bFGF的增殖迁移机制主要是通过PI3K/AKT通路以及MAPK经典通路的Erk调节细胞增殖迁移的能力。相反地,特异性阻断以上通路,ST2细胞的增殖迁移能力现象表达会减弱,且PI3K/AKT通路为主控信号通路,Erk仅为辅助通路。