蕨类植物是一类通过孢子繁殖的维管束植物,它的进化地位位于苔藓植物和种子植物之间。根据报道蕨类植物富含黄酮类化合物,其总黄酮含量的平均值高于苔藓植物和种子植物,但在蕨类植物中关于黄酮类化合物重要类群的花青素类化合物的研究却很少。花青素类化合物不仅是重要的植物色素,还具有保护植物免受多种生物和非生物因素胁迫的功能,能够清除自由基,减少光损伤,保护植物光合作用的顺利进行。一些蕨类植物的叶片呈现出深红色,这些色素类物质是否为花青素类化合物此前并没有报道。由于大多数蕨类植物的染色体数目多,已建立的可参考基因组较少等原因,目前对蕨类植物功能基因的研究还很少。尽管显花植物花青素合成途径及其分子机制研究已有一定基础,但在蕨类植物中的花青素类化合物合成过程还有很多不清楚的地方。尤其是参与花青素类化合物和原花青素合成的关键酶二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR),此前未有它在孢子植物中的功能报道。为了探讨蕨类植物中的花青素类化合物的成分以及其合成过程,本研究首先对44种蕨类的花青素含量和种类进行检测,分析花青素在蕨类中的分布情况。根据实验结果选择红盖鳞毛蕨(Dryopteriserythrosora)作为研究材料,采用转录组测序的方法从中筛选获得36条参与花青素类化合物合成的基因。最后,从蛋白结构预测、基因表达情况分析、体外酶活检测和转基因拟南芥等方面全面的分析红盖鳞毛蕨DFRs的功能。主要取得结果如下:1.分析了井冈山地区采集的7目,14科,44种蕨类植物的花青素、原花青素和总黄酮的含量。结果显示这些蕨类植物均含有花青素,其中乌毛蕨科植物中含有大量的矢车菊素(Cyanidin),而鳞毛蕨科植物中不仅有矢车菊素,还有较高含量的飞燕草素(Delphinidin),花青素的种类与科属表现出一定的相关性。此外,在乌毛蕨科和鳞毛蕨科大部分样本中检测到较高含量的原花青素和总黄酮。总的来看,乌毛蕨科和鳞毛蕨科植物在花青素、原花青素和总黄酮含量上表现出优势,鳞毛蕨科植物中的主要花青素类型更多。2.通过Illumina Hiseq 2000平台对红盖鳞毛蕨的转录组进行分析。注释到花青素生物合成相关途径上的基因主要涉及查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、DFR、类黄酮3’-羟化酶(F3’H)、类黄酮3’,5’-轻化酶(F3’5’H)、花青素合成酶(ANS)和类黄酮3-O-葡糖基转移酶(UFGT)。通过序列比对和系统发育树分析,发现这些基因与种子植物已报道的功能基因的相似度低且分属于不同的进化枝,这可能与蕨类植物特殊的演化地位有关。3.分析了红盖鳞毛蕨转录组数据中获得的5条DFR基因的功能。结果显示5条DeDFRs的ORF区长度为972-1026 bp,编码的氨基酸同拟南芥的相似性为39.02-46.34%。DeDFR1蛋白和DeDFR2蛋白具有DFR催化功能,不同于已有的报道,它们仅能催化DHK和DHQ转化为目标产物,但对DHM没有作用。拟南芥DFR缺失突变体回补实验结果显示DeDFR2基因能够使拟南芥恢复表型,种皮颜色加深。DeDFR3蛋白不具有与种子植物相似的体外催化底物的功能,且回补拟南芥突变体后对花青素含量没有影响,但它在拟南芥野生型中的过表达将加速拟南芥发育,使种子颗粒增大为1.33倍左右。DeDFR4蛋白和DeDFR5蛋白同样不具有体外催化的功能,在红盖鳞毛蕨中的检测结果显示它们主要在低光照条件下表达,且这两条基因的过表达拟南芥在低光条件下表现出更好的成长状态。总体而言,5条DeDFRs基因对植物生长具有不同的调节功能,DeDFR1和DeDFR2参与花青素类化合物的合成过程。4.发现一种新的DFR功能类型,即Arg型DFR。除了鉴定到DFR功能的DeDFR1和DeDFR2外,满江红AfDFR1-6和槐叶萍ScDFR1-4也属于Arg型DFR,这是一种在种子植物中未有报道的类型,可能为蕨类植物中特有。通过定点突变技术和体外实验检测关键位点对DFR活性的影响。结果显示当关键位点更改为Asp后,催化DHQ的能力下降;当关键位点更改为Arg后,催化DHK的能力下降,催化DHM的功能丧失。因此,关键位点上氨基酸残基的侧链的不同是影响底物催化能力的重要原因,Arg类型DFR的特征是能够催化DHK和DHQ,不能催化DHM。综上所述,本研究首先分析蕨类植物中花青素的分布情况,以含量较高的红盖鳞毛蕨作为研究对象通过转录组测序方法挖掘其中参与花青素类化合物合成的基因。通过研究DeDFRs基因的功能,探讨蕨类植物中的DFR基因对花青素类化合物合成的影响。这些工作不仅对研究植物DFR的功能演化、开发利用蕨类植物花青素类化合物、探索蕨类植物花青素类化合物合成等方面具有重要的价值,也为蕨类植物中其他功能基因的研究提供了资料和方法。