2-羟基吩嗪（2-hydroxyphenazine,2-OH-PHZ）对许多真菌及细菌均具有较强的拮抗作用,是一种潜在的生物农药。针对某些病原菌,2-OH-PHZ的拮抗作用强于吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid,PCA）。然而,无论是通过化学合成还是生物合成的方法,其产量都非常低。本课题通过研究2-OH-PHZ的合成机理及双组分调控系统RpeA/RpeB对其的调控机制,为提高其产量及大规模应用奠定了理论基础。目前2-OH-PHZ的合成路径基本明确:以PCA为前体,在单加氧酶PhzO的作用下生成2-羟基吩嗪-1-羧酸（2-hydroxyphenazine-1-carboxilic acid,以下简称2-OH-PCA）,2-OH-PCA脱羧形成关于2-OH-PHZ。但是关于其合成机理尚且存在争议,其中一个争论点在于PhzO是否是催化这一反应的唯一必需酶。本课题通过异源表达PhzO蛋白,并研究了不同条件对其生物活性的影响。结果证明28℃,pH=7.0条件下,PhzO生物活性最强。外源添加1mM的Fe³⁺能促进反应的进行。当PCA浓度>120mg/L时,2-OH-PHZ的产量反而降低。在此基础上优化了PhzO蛋白的表达条件,通过分子筛纯化获得PhzO蛋白酶,并研究其在不同条件下的酶活性。结果证明在Fe³⁺和NADP（H）的共同作用下,PhzO能成功修饰PCA生成衍生物。另一个关于合成机理的争论点则在于2-OH-PCA脱羧是否能够自发进行。本课题从本实验室构建并保藏的2-OH-PCA高产菌株绿针假单胞菌GP72AN（Pseudomonas chlororaphis GP72AN）出发,发酵制备2-OH-PCA,得到纯度为99.4%的2-OH-PCA样品。检测其在不同温度及pH条件下的脱羧反应,并对这一化学反应过程作了定量数学分析,结果发现这一转化过程是自发且对温度、pH敏感,符合一级反应动力学模型。本课题进一步探讨RpeA/RpeB对绿针假单胞菌GP72中PCA及其衍生物的生产的影响。RpeA/RpeB是GP72双组分调控系统中的一组。RpeA已被证实对GP72吩嗪合成起负调控作用。本课题通过PCR成功克隆鉴定了rpeA相对应的应答调控基因rpeB,并通过同源重组技术分别在野生型及GP72AN的基础上构建了rpeB基因突变株GP72BN和GP72ANBN。发酵实验结果表明在KB培养基中双组分调控系统RpeA、RpeB对吩嗪合成调控作用不同,rpeB突变株的PCA和2-OH-PHZ的产量均下降,而rpeA突变株的PCA和2-OH-PHZ的产量均上升。而在GP72BN中通过回补rpeB基因可以恢复其吩嗪合成能力。通过RT-PCR实验结果表明,相对于野生型,在GP72BN中,phzI/phzR和phzE转录水平均显著下调,而在GP72AN中相对于GP72BN phzI/phzR和phzE转录水平则显著上调。在GP72BN和GP72AN中phzO基因的转录水平变化均不显著。在野生型中,rpeA和rpeB在不同培养温度及培养基中转录水平差异显著。由此推测RpeA/RpeB对PCA合成的调控很有可能是通过对phzI/phzR和吩嗪合成基因簇的调控来实现的,进而调控其衍生物的合成,且rpeA/rpeB可能是环境依赖型双组分调控系统。进一步对双组分调控系统RpeA/RpeB对GP72吩嗪合成调控作用进行研究,结果显示在低磷培养基中,RpeA、RpeB对吩嗪合成都起正向调控作用。在假单胞菌中,存在于RpeA/RpeB上游的rndA/rndB主动外排系统基因十分保守,通过构建rndB突变菌株GP72RN,并研究其在不同培养基中对吩嗪合成的影响。结果发现尽管在KB培养基中RndB对吩嗪合成基本无影响,但在M9培养基中RndB正向调控GP72吩嗪合成。综上,本课题研究了2-OH-PHZ的合成机理及调控机制,阐明了2-OH-PHZ的合成机理及双组分调控系统RpeA/RpeB对其合成的调控机制,为2-OH-PHZ今后的进一步的研究及应用奠定了理论基础。