复杂药物体系分析包括了植物药有效成分的分析和生物样品中的药物及代谢产物的分析等。其主要特点有:(1)成分或基质复杂。一种植物药可能就含有上百种化学成分;而在生物样品中,许多内源性物质的存在往往很容易干扰到样品的准确定量分析。(2)生物样品的分析中,多数情况下是微量甚至痕量的。因此,发展高效、高选择性、高灵敏度的分析方法成为分析工作中的重要研究内容。毛细管电色谱(capillary electrochromatography, CEC)是一种在毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)技术的不断发展和高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)技术与理论日益完善的基础上逐步兴起的以电迁移原理和色谱分离原理相结合的新型分离分析技术,它结合了毛细管电泳的高效性和毛细管液相色谱(capillary liquid chromatography, CLC)的高选择性,是目前微分离分析领域的研究热点之一。毛细管电色谱的分离结合电泳作用力和色谱分配作用两种分离机制,通过溶质在流动相和固定相之间的分配系数的不同和自身电泳淌度的差异实现,具有快速、灵敏、样品和溶剂消耗少等优点。根据分离过程中驱动力的不同可以将毛细管电色谱分为电渗流驱动型和压力电渗流双重驱动型电色谱两种技术。电渗流驱动型毛细管电色谱以电渗流为驱动力,使样品区带保持平塞型流型,因此柱效好,灵敏度高;压力驱动型电色谱即加压毛细管电色谱(pressurized capillary electrochromatography, pCEC),在使用电渗流(electroosmotic flow,EOF)的同时使用压力作为驱动力,这样可以加快分析速度,便于梯度洗脱,减小在使用填充柱时由于柱塞引起的气泡问题。毛细管电色谱柱在毛细管电色谱分离体系中占据最重要的地位,它具有双重作用:一是作为固定相,承担对对象的分离任务;二是在其表面形成双电层,在电场作用下产生EOF作为驱动力。根据固定相的材质以及制备方法的不同,毛细管电色谱柱分为毛细管开管柱(open tubular capillary columns)、毛细管填充柱(packed capillary columns)和毛细管整体柱(monolithic capillary columns)。毛细管开管柱主要通过涂布、键合和溶胶-凝胶等方法在柱内壁制备薄层固相,使溶质在依靠电泳淌度的差异进行分离的基础上,辅以一定的色谱分离机理,所以制备关键是如何通过增大表面积来增大柱容量。开管柱的优点是柱效高,但相对于填充柱和整体柱,其相比低、柱容量小且重现性较差。将色谱用颗粒固定相装填入毛细空管而成的毛细管填充柱,目前技术最为成熟且已经商品化,可以说是高效液相色谱柱的一种微型化应用。这种柱技术继承了传统液相色谱柱选择性好的优点,又解决了开管柱相比低、柱容量小、重现性较差的问题。但是由于柱填充和柱塞的制备工艺对操作者要求比较高,且柱塞的存在增大了气泡产生的风险和柱折断的概率;另外,由于使用键合硅胶作为固定相,使流动相的pH范围只能选择在2～8之间,这些缺点使毛细管填充柱的应用受到了一定的限制。与毛细管填充柱不同的是,毛细管整体柱由聚合液在毛细管内原位聚合而成,无须制备柱塞,柱长也可方便地加以控制,可根据基体及表面官能团的需要选用不同的有机单体进行聚合反应,也可通过对参加反应的单体或不参与反应的致孔剂比率加以调控而灵活地控制聚合物的孔隙率等参数。具有制备方法简单,内部结构均匀,通透性、重现性好,柱效高,固定相表面易于改性,无需制备柱塞和可进行快速分离等优点,近几年发展迅速,被广泛地应用于各种酸性、碱性及中性小分子、核酸、氨基酸、多肽及蛋白质大分子生物样品、食品样品及环境样本等复杂微量体系的分离分析。根据所制备的整体材料的不同,整体柱分为有机聚合物整体柱、无机聚合物整体柱和颗粒固定化整体柱。其中有机聚合物整体柱的制备方法是将单体混合物(功能单体、交联剂以及电渗流产生剂)、致孔剂混合物(通常为二元或三元致孔剂)和引发剂的混合溶液加入空管柱中通过热引发或光引发聚合。反应完全后用有机溶剂和水除去致孔剂及其它未反应化合物即可。但是毛细管整体柱也存在一些问题:这种柱制备技术是近二十年才逐渐发展起来的新兴柱技术,因此在很多方面还只是处于研究探索阶段,就本课题所研究的甲基丙烯酸酯类整体柱而言,目前制备技术较为成熟的为引入短链功能单体的甲基丙烯酸丁酯整体柱,这种整体柱中的功能基团为四个碳的烷链,在相同条件下,选择性势必弱于以ODS为填充固定相的毛细管填充柱。若没有合理的控制各聚合液成分的配比的情况下引入长链功能单体,柱效反而不如短烷链的整体柱。综上所述,毛细管填充柱以及毛细管整体柱也各有其优缺点,不同驱动模式的毛细管电色谱具有不同的特点和使用范围。本课题对这两种毛细管柱在上述提及的两种不同毛细管电色谱技术上的应用进行了考察,对其适用性进行探讨和研究。研究表明pCEC是一种以压力为主要驱动力,EOF为次要驱动力的电色谱技术,或可称之为电压辅助的微径液相技术,某种意义上来说,类似于传统液相柱的毛细管填充柱由于优越的选择性与其更为匹配;另一方面,主要使用压力作为主要驱动力的pCEC又可以有效地抑制毛细管填充柱易产生气泡的问题,同时,采用梯度洗脱的手段可以更加快速有效的进行复杂样品的分离。综上我们认为使用毛细管填充柱的pCEC技术在分离分析复杂样品上,具有优越表现,如中药指纹图谱的建立。毛细管整体柱由于没有柱塞,避免了填充柱中相不均匀性造成的气泡问题,更为适用于基本上只有EOF作为驱动力的常规CEC技术,且毛细管整体柱通透性更好,所以可以实现柱效更高的快速分离分析,如中药主要有效成分的质量控制以及生物体内样品的分析。具体研究工作包括:1.南北五味子所含木脂素的种类及其含量的差别较大,但市场流通中二者混用现象较为普遍,因此利用pCEC等度技术和自制毛细管填充柱,以五味子中七种木脂素作为特征成分,并对其中五种进行分离分析和含量测定,达到质量控制的目的。2.针对等度洗脱复杂样品耗时较长的问题,进一步运用pCEC梯度洗脱技术,成功分离银杏叶提取物中多种黄酮醇苷类成分,完成其指纹谱的初步建立。在此基础上,将商品化毛细管填充柱和自制毛细管有机聚合物整体柱同时运用于此技术,对其分离机理和性能进行比较和评价。发现在pCEC模式下,以ODS为填料的毛细管填充柱在分离效果和选择性上优于以甲基丙烯酸丁酯作为功能单体的甲基丙烯酸酯类整体柱,说明相较于甲基丙烯酸酯类整体柱,填充柱与pCEC模式更为匹配。但是,这种技术也存在一些制约其进一步发展的不足:(1)pCEC无冷凝系统,无法解决焦耳热问题,进而无法施加较高电压,电色谱优势无法完全得以体现,待分析物质主要是依靠色谱机理分离,使得其应用范围具有一定局限性;(2)毛细管填充柱的制备对装填技术要求较高,且由于毛细管柱两端需要烧制柱塞,使得填充柱易产生气泡,影响分离分析。毛细管整体柱采用原位聚合法,制备过程简单方便,通透性好,同时避免了在柱两端烧制柱塞的问题。所以寻找适宜整体柱的电色谱模式可以很大程度上拓展其应用范围。3.商品化的电泳仪既配有冷凝系统,又可以在柱两端施加较高的直流电压,使得运用整体柱进行分离时在施加高电压时不致产生过大的焦耳热,且在电泳仪上进行电色谱实验时,平塞流型的EOF作为主要驱动力,使色谱峰型更为尖锐,柱效更高。因此本章首先对甲基丙烯酸酯类整体柱的单体混合物比例以及三元致孔剂的比例进行进行了单因素考察和优化;其次,在结合快速分离和柱效优化的基础上选取最为合适的整体柱建立快速分离、分析蛇床子提取物中主要活性成分异虎耳草素、香柑内酯、欧前胡素以及蛇床子素的CEC方法,并将其与HPLC,pCEC进行比较,结果证明运用有机聚合物整体柱的CEC方法,在保证所有物质基线分离的基础上,分析时间明显缩短且柱效更高。4.本章在上一章的研究基础上,又对白芷提取物中的主要活性成分欧前胡素、珊瑚菜内酯、发卡二醇以及异欧前胡素进行分离分析和含量测定,并采用目前广泛使用、技术较为成熟的甲基丙烯酸丁酯整体柱制备技术,在流动相中添加去氧胆酸钠作为“动态固定相”,增加分离选择性,成功解决了该柱因功能性基团碳链较短(C4)而造成的固定相选择性不高,溶质保留不够的缺点,成功对白芷中五种较难单纯使用甲基丙烯酸丁酯整体柱分离的香豆素成分进行快速有效地分离分析。5.鉴于毛细管整体柱的CEC方法具有快速有效的特点,拓展其应用范围,对抗抑郁药米氮平进行了临床药代动力学研究。首先考察了不同电渗流产生剂对电渗流方向、样品峰型及灵敏度的影响,最终选择无电渗流的甲基丙烯酸酯整体柱进行实验。接下来通过在线场放大样品富集技术(field-amplified sample injection,FASI)解决毛细管微分离系统中的浓度检测限较低的问题,最终选择70%乙腈作为样品溶剂,使样品和主要代谢产物的定量下限均达到2ng/mL。最后,采用液液萃取为前处理方法,使用CEC技术对人血浆样品中的米氮平及其主要代谢产物去甲米氮进行分离,实现了常规实验条件下快速、经济地分离分析,并成功应用于其临床药代动力学研究。尽管目前为止,运用毛细管整体柱的CEC技术在分离分析方面有其独到之处,但是增强其选择性仍然是不懈追求的方向。本文在上述实验的基础上,对今后研究工作的思路和方向进行了一定的探索和展望。采用中心组合设计法对中等长度碳链(C8)作为功能单体的甲基丙烯酸辛酯柱中的各成分配比进行优化考察。选择色谱响应参数作为因变量,对单体混合物与致孔剂混合物比例、单体混合物中功能单体与交联剂的比例、致孔剂中1,4丁二醇和正丙醇的比例这三个自变量进行二项式拟合,运用响应面函数求出聚合液各成分最佳配比的范围。为今后制备保留更强的长烷链有机聚合物整体柱奠定基础。