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花生(Arachis hypogaea L.)是一种双子叶植物纲的豆科植物,富含蛋白质和油脂,是我国重要的油料作物和经济作物,具有较高的利用价值。花生具有地上开花、地下结果的特性,光信号对花生荚果发育起着重要的调控作用。光敏色素phyA和phyB是光信号的受体,拟南芥中的研究表明,光活化的phyB能够直接与BES1互作从而调控下胚轴伸长。BES1是油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)信号转导的关键转录因子,BR作为类固醇类植物激素调节植物生长、胚胎发育等过程。但是光信号和BR是否协同调控花生荚果发育过程还不清楚。本实验室在前期研究基础上获得了 phyARNAi多个转基因株系并发现这些株系均出现地上结果现象,通过对荚果不同发育时期激素含量的测定和phyARNAi株系地上果针表达谱分析,我们推测BR是参与调控花生荚果膨大的关键激素。在此基础上,对AhBES1进行了克隆、表达及转基因功能研究,以及AhBES1与AhphyA和AhphyB的互作研究,从而初步解析了光信号和BR调控花生荚果发育的作用机理。本实验主要研究结果如下:1.不同发育时期花生果针激素含量测定:果针入土后的膨大过程中,IAA的含量变化是保持下降趋势;在果针入土后,BRs中的6-脱氧油菜素甾酮含量下降,入土 6 d果针膨大时含量最低,随着果针膨大,含量又上升;在入土 4 d-6 d果针膨大前ABA含量升高,随着果针的膨大,ABA含量又下降;GA1、GA3、GA8的含量变化相对一致,入土 6 d后含量显著升高,这些结果表明BR和GA可能对荚果膨大起促进作用。2.数字基因表达谱分析:在LH14和phyARNAi的花生果针中,生长素、GA、ABA、乙烯、BR相关基因的表达发生了变化。与LH14相比,phyARNAi中筛选到与植物激素相关的表达差异显著的基因,其中包括26个与生长素相关的基因,13个与赤霉素相关的基因,18个与乙烯相关的基因以及15个与BR相关的基因。在BR相关的表达差异显著的基因中,protein brassinosteroid insensitive 1、brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1、interleukin-1 receptor-associated kinase 4共4个基因表达下调,其他11个基因均表达上调,包括与 BR 合成相关的基因 brassinosteroid-6-oxidase 1 和 3-epi-6-deoxocathasterone 23-monooxygenase,编码BR信号转导途径中的关键受体蛋白BRI1和BAK1相关的基因 protein brassinosteroid insensitive 1、brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1以及BR重要的转录因子BZR1/BES1相关的基因brassinosteroid insensitive 1-associated、BES1/BZR1 homolog protein 2 等。这些基因表达水平的显著差异表明,在激素调控花生荚果膨大的过程中,BR可能是参与调控花生荚果膨大的关键激素。3.AhBES1基因克隆及功能分析:在栽培花生LH14中克隆到AhBES1 948 bp的全长CDS序列,编码315 aa。通过构建AhBES1基因的过量表达载体转化拟南芥、构建AhBES1基因干扰表达载体转化花生以及利用CRISPR技术编辑AhBES1基因获得Ahbes1突变体来验证AhBES1基因的功能。4.BR与光信号的互作反应:通过构建AhphyA、AhBES1的重组质粒,利用酵母双杂交技术探究其互作关系。结果表明AhBES1与AhphyA-N不存在相互作用,但还需要进一步验证AhBES1与AhphyA-C、AhphyA的互作反应。