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背景:结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的严重危害人类健康的人畜共患病,巨噬细胞作为M1B的主要宿主细胞和靶细胞可以通过自噬作用清除胞质中游离的病原体,有效抑制MTB在宿主细胞内的增殖;而MTB又可逃避自噬作用逃逸到细胞基质中,为自身在胞内增殖创造有利条件。但是,由于自噬涉及复杂的生物学过程,其调控机制尚未完全阐明。Wnt/β-catenin信号作为参与细胞多种生命活动的重要通路,近年来发现其参与多种疾病中细胞自噬的调控作用,包括神经退行性疾病以及癌症等。但Wnt/β-catenin信号是否参与调控结核分枝杆菌感染诱导巨噬细胞自噬尚未见相关报道。因此,本研究拟探讨Wnt/β-catenin信号在结核分枝杆菌感染诱导巨噬细胞自噬过程中的调控作用。目的与方法:本研究采用卡介苗菌株BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并通过Wnt3a条件培养基和转染DKK1质粒分别激活和阻断Wnt/β-catenin信号通路。结合透射电子显微镜和流式细胞术,RT-PCR、Western Bloting和mRFP-GFP-LC3双荧光标记蛋白等技术,分别从细胞形态学水平和细胞分子水平,探讨Wnt/β-catenin信号对结核分枝杆菌感染诱导小鼠巨噬细胞自噬的调控作用;随后进一步用雷帕霉素(Rapamycin)来研究该信号对自噬诱导环节的调控是否通过mTOR-dependent途径。结果:(1)通过对细胞形态学和分子水平检测发现,BCG在不同感染时间和不同感染复数下均诱导巨噬细胞发生不同程度自噬,当BCG感染巨噬细胞12h,感染复数为10时,巨噬细胞内参与自噬体膜形成的关键蛋白LC3的mRNA及蛋白表达水平极显著高于对照组(P<0.01),且巨噬细胞内出现自噬体和自噬溶酶体。由此成功构建BCG感染诱导小鼠巨噬细胞自噬的理想细胞模型,为后续试验奠定基础。(2)BCG感染巨噬细胞后,激活Wnt/β-catenin信号通路,参与自噬体膜形成的关键蛋白LC3、Atg5、Atg7、Atg12mRNA及蛋白表达水平下调,参与泛素化底物的蛋白P62mRNA及蛋白表达水平上调,自噬溶酶体及自噬流的形成被抑制,自噬率降低;而阻断Wnt/β-catenin信号通路后,巨噬细胞内LC3、Atg5、Atg7、Atg12mRNA及蛋白表达水平上调,P62mRNA及蛋白表达水平下调,促进自噬溶酶体及自噬流的形成。(3)BCG感染巨噬细胞后,激活Wnt/β-catenin信号通路,mTOR依赖途径的上下游关键蛋白PI3K、p-AKT和p-mTORmRNA及蛋白表达水平上调;而阻断Wnt/β-catenin信号通路,巨噬细胞内以上蛋白表达水平下调。且雷帕霉素会上调BCG感染后巨噬细胞内LC3、Atg5、Atg7、Atg12 mRNA及蛋白表达水平,下调P62、PI3K、p-AKT和p-mTORmRNA及蛋白表达水平。结论:通过设置BCG感染的时间梯度和浓度梯度,确定BCG感染巨噬细胞12h,感染复数为10时,巨噬细胞发生明显自噬,成功构建BCG感染诱导小鼠巨噬细胞自噬的细胞模型;进一步发现Wnt/β-catenin信号通路,通过下调自噬体膜形成的几种重要蛋白从而抑制巨噬细胞内自噬溶酶体及自噬流的形成,降低巨噬细胞自噬率,抑制巨噬细胞自噬;且Wnt/β-catenin信号通路可能通过激活mTOR依赖性途径上下游蛋白的表达,从而抑制BCG感染诱导巨噬细胞的自噬。