目的糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病,主要分为1型和2型,其中2型糖尿病尤为常见。糖尿病在全球呈广泛流行趋势,中华医学会糖尿病学分会的糖尿病流行病学调查结果显示,2017年我国2型糖尿病患者已超过1亿,位居世界首位。其中,30岁以上人群中,2型糖尿病患病率达11.6%。每年有490万人死于糖尿病,其中约50%人死于心血管并发症。糖尿病患者中,不依赖于动脉粥样硬化、高血压及其他潜在病理因素发生的左心室功能障碍性疾病称为糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)。研究报道认为,2型糖尿病患者中,DCM的发病机制主要是心肌细胞自噬功能障碍,而持续高糖及高脂环境是引起心肌细胞自噬功能障碍的主要因素。发生2型糖尿病时,心肌细胞在高糖和高脂环境下,发生胰岛素抵抗,心肌细胞的能量代谢平衡被打破,细胞内蛋白质和脂质氧化增强,引起细胞自噬功能障碍,使受损细胞器及有害的代谢产物无法清除,因而导致心肌细胞死亡,发生DCM。虽然已经明确凋亡在DCM发生中的作用,但调控凋亡的具体机制尚未明确。因此,明确DCM中潜在的凋亡调控机制已成为亟待解决的医学问题。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A stimulated genes,CREG)是小分子糖蛋白,是重要的心肌保护因子,可通过多种途径参与心肌保护作用。本实验室近年研究发现:(1)CREG蛋白在心肌组织中高表达;(2)心肌梗死、血管紧张素Ⅱ或缺血再灌注等病理性损伤可使心肌细胞中的CREG表达显著下调,而补充外源性CREG蛋白则可挽救上述病理因素引起的心肌损伤;(3)更为重要的是,研究还证实CREG是定位于溶酶体的糖蛋白,可通过调控溶酶体的发生和功能从而影响心肌成纤维细胞自噬功能。基于上述研究结果,我们假设CREG作为心肌细胞自噬稳态的内源性关键调控基因,可能参与了DCM发生。然而CREG在DCM中参与凋亡调控的具体机制尚未明确。因此,本研究的主要目的是从细胞学角度入手,明确CREG调控高糖高脂刺激下心肌细胞凋亡的作用及可能机制。方法(1)采用不同浓度棕榈酸(0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM),及不同浓度高糖(10mM、15mM、25mM、33mM)刺激大鼠H9C2心肌细胞,western-blot检测CREG蛋白表达水平,确定高糖高脂的最佳刺激浓度。同时,在高糖高脂刺激的不同时间点(12h、24h、36h、48h),检测CREG蛋白表达变化,确定高糖高脂的最佳作用时间。(2)为明确高糖高脂作用下CREG与心肌细胞自噬的相关性,构建CREG过表达及CREG低表达的H9C2心肌细胞模型,并采用高糖高脂刺激24h。Western-blot检测自噬体蛋白(autophagy marker light chain 3BⅡ,LC3BⅡ)、自噬底物蛋白P62、溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)、凋亡蛋白cleaved-caspase3表达;免疫荧光染色检测溶酶体酶casthepsinB和casthepsinD表达;流式细胞术检测心肌细胞凋亡比例。(3)为明确CREG是否通过调控自噬影响心肌细胞凋亡,分别采用自噬抑制剂氯喹(10mM)及自噬激动剂白藜芦醇(10mM)对CREG过表达H9C2心肌细胞及CREG低表达H9C2心肌细胞进行干预24h,再给予高糖高脂刺激24h。采用western-blot、免疫荧光染色以及流式细胞术分别检测CREG蛋白、LC3BⅡ、P62、LAMP1、cathepsinB、cathepsinD及Cleaved-caspase3表达变化。结果(1)采用不同浓度棕榈酸及高糖刺激H9C2心肌细胞,western-blot结果发现高糖浓度为33mM和棕榈酸浓度为0.4mM条件下,CREG蛋白表达明显减少。因此,确定高糖和棕榈酸的最佳刺激浓度分别为33mM和0.4mM。此外,在高糖高脂刺激24h后,CREG蛋白显著降低,并随刺激时间延长,CREG表达逐渐下降。(2)H9C2心肌细胞在高糖(33mM)和高脂(0.4mM)刺激24h后,western-blot检测发现CREG蛋白表达降低,LC3BⅡ和P62表达增多,LAMP1表达减少,凋亡蛋白cleaved-caspase3增加。免疫荧光检测显示溶酶体酶cathepsinB和cathepsinD减少。同时,流式细胞术发现心肌细胞凋亡明显增加。以上结果提示:在高糖高脂刺激下,H9C2心肌细胞中CREG蛋白表达减少,溶酶体数量及功能异常,自噬功能障碍,细胞凋亡增多。(3)为进一步明确CREG在高糖高脂刺激下对心肌细胞自噬的作用,采用腺病毒CREG及CREG siRNA分别构建CREG过表达(Ad-CREG)及CREG低表达(CREG-siRNA)的H9C2心肌细胞。Western-blot检测CREG表达变化,结果证实CREG过表达及低表达的H9C2心肌细胞模型均成功构建。然后,对Ad-CREG组及CREG-siRNA组H9C2心肌细胞分别进行高糖及高脂刺激24h,检测自噬及凋亡相关蛋白表达。结果发现:Ad-CREG联合经高糖高脂刺激24h后,LC3BⅡ、LAMP1表达较对照组显著增加,而P62及cleaved-caspase3明显降低;同还发现Ad-CREG组中溶酶体酶cathepsinB和cathepsinD表达增多以及心肌细胞凋亡比例降低。此外,研究还发现,CRGE-siRNA联合高糖高脂刺激后,LC3BⅡ和P62表达增加,LAMP1、cathepsinB和cathepsinD表达减少,心肌细胞凋亡显著增加。以上结果提示:在高糖高脂刺激下,CREG参与H9C2心肌细胞自噬,并影响其凋亡。(4)为进一步明确CREG对高糖高脂刺激下心肌细胞自噬的调控机制,采用自噬激活剂或抑制剂分别进行干预。结果发现:Ad-CREG-HG+PA组经氯喹干预后,CREG蛋白下调,自噬受阻(LC3BⅡ和P62表达增加,LAMP1、cathepsinB和cathepsinD表达降低),细胞凋亡比例增加。CREG-siRNA-HG+PA组经白藜芦醇干预后,自噬通路改善(LC3BⅡ表达增加,P62表达降低),溶酶体指标表达增加(LAMP1、cathepsinB和cathepsinD表达增加),细胞凋亡减少。上述研究结果证实:在高糖高脂刺激的H9C2心肌细胞中,CREG可通过调控溶酶体参与自噬,进而影响心肌细胞凋亡。结论H9C2心肌细胞在高糖高脂刺激下,CREG蛋白表达显著下降,自噬流障碍,细胞凋亡增加。过表达CREG后可改善自噬流障碍及减少细胞凋亡,而低表达CREG后自噬障碍及细胞凋亡加重。通过自噬抑制剂及自噬激活剂干预后证实,CREG可通过调控溶酶体参与自噬,进而影响心肌细胞的凋亡。