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一．研究目的： 本研究的拟建立成熟的、功能良好的DC细胞的培养体系，即：DC细胞形态典型、表达特征性的CD分子、能够诱导T淋巴细胞活化、增殖、亚群分化、分泌特征性细胞因子；研究DC细胞的超微结构并在纳米级水平上做进一步结构分析，用荧光探针寻找DC细胞成熟标志的CD分子（CD83、CD1a）、第二信号CD分子（CD86、CD80）和代表亚群来源的CD11c分子的表达位置，推测免疫应答的发生部位；观察免疫应答时DC细胞与T淋巴细胞的相互作用、形态学变化和Ca2+的动态变化。 二、材料和方法： （一）主要试剂和设备： 1．试剂： AIM-V培养基、rhGM-CSF、rhIL-4、小鼠抗人FITC标记的CD86、HLA-DR、CD11c、Lin-1、CD4、IgG2a、CD45RA、CD69、Lin-1及小鼠抗人PE标记的CD83、CD86、CD80、CD3、CD123、CD40、CD4、CD25、CD28、CD45RO、IFN-γ和IL-4；小鼠抗人CD4-APC、CD8PE—Cy5、HLA-DR-percp、Mouse IgGl-PE和Mouse IgGl-FITC的MoAb；Annexin V-FITC／PⅠ双染法流式细胞分析试剂盒。 2．设备： 二氧化碳电热恒温箱、流式细胞仪、Nikon倒置显微镜及相机、扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、共聚焦显微镜 （二）实验方法 1．对有无悬浮细胞的条件下，用含有rhGM—CSF 800?／ml、IL-4 500?／和TNF-α250?／ml的无血清培养基，诱导培养DC细胞，并在光镜下每天记录形态学变化； 2．胞仪分析DC细胞Lin—HLA-DR+细胞群的CD83、CD1a、CD86、CD80、CD11c、CD123的表达情况； 3．胞仪分析DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69变化，进而分析CD4+T细胞的CD4／CD3、CD4／CD25、CD45RO／CD45RA、CD4／CD28亚群以及CD8+T细胞的CD8／CD3、CD8／CD25、CD45RO／CD45RA、CD8／CD28亚群比例的变化情况;4.当DC细胞被抑制时，用RNAase抑制RNA、核酸染料PI标记细胞DNA，在流式细胞仪上分析在T细胞的周期变化;5.流式细胞仪分析T细胞分泌的细胞因子IFN一Y和IL一4的情况，间接获悉T细胞的定向分化;6.AnnexinV一FITC/PI双染法流式细胞分析试剂盒分析DC细胞递呈抗原后的凋亡情况;扫描电镜和透射电镜分析DC细胞表面和细胞内的超微结构，寻找其结构特征;7.利用AFM在纳米水平上进一步分析DC细胞的超微结构以及其与T细胞作用方式;8.免疫电镜观察CD86的表达位置;9.利用共聚焦显微镜分析DC细胞的特征性CD分子的表达情况，观察DC细胞与T细胞的作用过程、DC细胞吞噬抗原的过程、DC细胞内游离CaZ十的变化过程以及DC细胞凋亡的过程三、结果:1.光镜下见贴壁细胞在培养过程中（7天）逐渐长出长短不一树突状突起，细胞形态不一;电镜观察到DC表面呈多层“面纱”覆盖，有大量皱褶，“面纱”边缘有长短不一的不规则的树突状突起，每个突起有多级分枝;AFM见DC细胞的“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成的，各个DC细胞之间的突起相互连接，构成集落;2.DC细胞表型在Lin--和HLA一DR+细胞群中，各CD分子表达的百分比为:CD123/54.5、CDlle/88.99、CD4O/56.65、CDla/69.36、CD86/92.57、CDSO/70.79、CD83/85.91;3.DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69明显升高，CD4+CD69+/19.05%;CDS+CD69+/21，93%;4.CD4+和CDS+的两组细胞的CD3+、CD25+、CD45RO+/CD45RA+的百分率均增高，CD28+的百分率和CD45RO一/CD45RA+的百分率均下降;CD4+/CD28-和CDS+/CD28一的百分率亦升高;5.DC细胞递呈抗原后，T细胞的S期细胞的比率从0.66%增加为7.21%;而DC的死亡率和凋亡率，分别由0.05%和0.00%升为6.95%和4.65%; 36.DC细胞含有丰富的线立体、微管和微丝系统;凋亡的DC细胞，其细胞核染色质固缩，内吞体严重扩张，细胞膜空泡化;7.CD86分子主要聚集于胞体特定的区域内，突起部位表达较少，CD83和CDla表达在细胞膜上，而CDllc则表达在细胞体部位;8.羊抗小鼠IgG一F工TC分子随时间不同逐渐由细胞膜分布到整个DC细胞;9.DC细胞递呈抗原后，CaZ+浓度升高，随即细胞破裂。四.结论:1.该方法可以诱导出的成熟DC细胞，形态典型，而且少量悬浮细胞不影响DC细胞的分化和成熟;“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成，扩大了DC细胞的膜结构，是有效捕获抗原的结构基础;2.DC细胞多个亚群可共存生长，绝大多数为MDC，而且成熟度高并表达丰富的双信号分子;3.DC细胞具有吞噬功能，可以诱导T细胞活化、增殖，具有递呈抗原功育旨;4.DC细胞递呈抗原后，在T细胞的作用下，DC细胞伴随细胞内CaZ十浓度的升高走向凋亡和死亡，且凋亡为非同步性。