【摘 要】
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背景骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是一组异质性髓系克隆性疾病,可高风险向急性髓系白血病转化（acute myeloid leukemia,AML）。异常的DNA甲基化是MDS患者的重要特征并与MDS的疾病进展密切相关。去甲基化药物成为临床中治疗该病的首要选择,但其耐药不可避免。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是调控机体适应低氧的主要转录调节因子,研
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背景骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是一组异质性髓系克隆性疾病,可高风险向急性髓系白血病转化（acute myeloid leukemia,AML）。异常的DNA甲基化是MDS患者的重要特征并与MDS的疾病进展密切相关。去甲基化药物成为临床中治疗该病的首要选择,但其耐药不可避免。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是调控机体适应低氧的主要转录调节因子,研究发现HIF-1α的高表达与多种恶性肿瘤的化疗耐药存在密切联系。但关于HIF-1α在MDS去甲基化药物耐药中的作用尚不清楚。因此,本研究建立了MDS去甲基化药物耐药细胞株,进一步探究其耐药性及HIF-1α表达与去甲基化药物耐药的关系。目的建立MDS去甲基化药物阿扎胞苷（AZA）耐药细胞株,分析其特性,检测HIF-1α在MDS耐药细胞及亲本细胞中的表达水平;应用化学诱导剂氯化钴（Co Cl2）在体外诱导低氧微环境,同时应用AZA处理MDS耐药细胞及亲本细胞,检测其凋亡、增殖及HIF-1α表达水平,探讨低氧对MDS去甲基化药物耐药的影响及其作用机制。方法1.采用药物逐步递增法建立体外AZA诱导的MDS耐药细胞株;采用CCK-8法检测其增殖与活力,绘制药物浓度与抑制率图,计算出各组细胞的半数抑制浓度（IC50）,并求得耐药细胞的耐药指数（RI）;应用流式细胞术检测在相同药物浓度下不同时间内细胞的凋亡情况;通过Transwell迁移实验以及克隆形成实验分析其在增殖迁移方面的差异。2.通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测耐药细胞与亲本细胞中HIF-1α的表达水平;流式检测常氧、低氧不同条件下亲本细胞和耐药细胞应用AZA处理后细胞的凋亡情况,同时检测其在有无AZA作用时的生长状况;随后在低氧条件下将亲本细胞及耐药细胞加入AZA 0h、24h、48h,设立不加AZA的细胞作为对照,检测HIF-1α不同时间内不同情况下的表达水平,探讨低氧对MDS去甲基化药物耐药的影响。结果1.成功构建了MDS去甲基化药物AZA耐药细胞株,耐药细胞在不同时间段的IC50均高于亲本细胞,生长增殖速度相对缓慢,但迁移的能力明显增强,且在药物作用下凋亡率下降（P＜0.05）。2.HIF-1α在耐药细胞中的表达水平明显升高（P＜0.05）;在低氧条件下,亲本细胞对去甲基化药物的耐受性增强,其凋亡率明显下降（P＜0.05）,在常氧、低氧不同条件下,去甲基化药物均能抑制亲本细胞的增殖,但耐药细胞的增殖几乎没有受到影响;低氧下亲本细胞中HIF-1α的表达水平有所增加,而耐药细胞中HIF-1α的表达水平始终明显升高（P＜0.05）。结论本研究表明,去甲基化药物耐药细胞株构建成功,细胞发生耐药后其生长增殖能力较前减弱,但易发生迁移且不易凋亡;HIF-1α在MDS耐药细胞中m RNA及蛋白的表达水平均明显升高;在低氧微条件下,亲本细胞生长受抑制,表达HIF-1α;耐药细胞生长抑制不明显,HIF-1α表达增高较亲本细胞明显,而且不受阿扎胞苷影响。综上所述,HIF-1α在MDS去甲基化耐药的发生过程中可能有一定作用,可本课题有望通为MDS耐药的靶向治疗提供一定的实验室基础和理论依据。
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