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飞蝗(Locusta migratoria)为世界性农业害虫,蝗灾发生面积广,致灾严重。飞蝗除了具有群集性、迁飞性外,还具有极强的繁殖能力,这是造成种群数量大,危害严重的原因。节间膜(Intersegmental membrane)在昆虫运动、交配、产卵等行为中具有重要作用。飞蝗腹部伸入土下产卵依赖于节间膜的延展性,雌性飞蝗在成虫期腹部长度约为2-3 cm,而当它在产卵时腹部可以延伸至8-10 cm,腹部的这种大幅度的延伸与其体节间的高度延伸膜(节间膜)有关。本文以飞蝗为研究对象,通过对雌雄成虫节间膜进行转录组测序,筛选到2个差异表达的表皮蛋白基因,围绕这2个表皮蛋白基因,进行了分子特性、表达特性分析,并基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术结合透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)以及动物行为智能实时监控技术探讨了其在飞蝗节间膜结构形成及产卵行为中的生物学功能。主要研究结果如下:(1)雌雄虫节间膜差异表达基因筛选与鉴定节间膜延展性测定结果显示,飞蝗雌雄虫节间膜延展性存在显著差异。摘取雌雄虫节间膜组织样品,提取样品总RNA进行转录组测序,共得到428个在雌雄飞蝗节间膜差异表达基因,发现腹部表皮蛋白基因LmAbd-1和LmAbd-6在雌雄节间膜表达差异分别达到40%、66.5%;RT-qPCR结果显示LmAbd-1和LmAbd-6在雌虫节间膜的表达量分别是雄虫的1.5倍和125.6倍。(2)LmAbd-1和LmAbd-6的分子特性与表达分析生物信息学分析显示:LmAbd-1和LmAbd-6基因序列均含有2个外显子,其氨基酸序列均含有1个信号肽和1个几丁质结合域4(chitin binding domain 4);其中LmAbd-1为经糖基化修饰的表皮结构糖蛋白,其与LmAbd-6均属于CPR家族RR-1亚类表皮蛋白。不同组织表达分析显示,LmAbd-1和LmAbd-6在表皮中(尤其是节间膜)特异性高表达且具有雌雄表达差异(雌性显著高于雄性),并且在第4-5、第5-6、第6-7腹节节间膜处高表达;不同发育时期表达分析表明,LmAbd-1和LmAbd-6在飞蝗若虫期的前期高表达,在成虫期的表达量显著高于若虫期。保幼激素类似物(juvenile hormone analogue,JHA)诱导结果显示LmAbd-1和LmAbd-6的表达量均上调,而分别干扰其受体基因Met和其响应基因Kr-h1后LmAbd-1和LmAbd-6的表达量均显著下调,表明JH信号能够调控LmAbd-1和LmAbd-6的表达。(3)LmAbd-1和LmAbd-6多克隆抗体制备与组织定位构建原核表达载体,转化大肠杆菌,表达并纯化了LmAbd-1和LmAbd-6重组蛋白,将重组蛋白分别免疫新西兰大白兔和小鼠制备LmAbd-1兔源多克隆抗体和LmAbd-6鼠源多克隆抗体。利用制备的多克隆抗体,通过免疫组化技术对LmAbd-1和LmAbd-6进行组织定位。结果显示,LmAbd-1和LmAbd-6均存在于节间膜内表皮层且与几丁质重叠,而不存在于腹部表皮层中。(4)LmAbd-1和LmAbd-6对飞蝗发育及节间膜结构的影响设计LmAbd-1和LmAbd-6 RNA干扰特异引物,体外合成dsRNA,dsGFP作为对照。从5龄飞蝗雌性若虫的第2和第3腹节交界处将10μg dsRNA注入体内,设置3组平行实验,即LmAbd-1 RNA干扰,LmAbd-6 RNA干扰,LmAbd-1和LmAbd-6RNA双干扰,观察飞蝗的蜕皮及节间膜发育情况。结果显示,沉默LmAbd-1和LmAbd-6后,雌虫飞蝗腹部出现了不同程度节间膜外露且节间膜与表皮不能正常套叠的异常表型。扫描电镜结果显示,与对照组相比,沉默LmAbd-1和LmAbd-6的飞蝗节间膜上表皮出现不规则排布,片层间隙减小,出现扭曲、重叠现象;透射电镜结果显示,相对于对照组,处理组飞蝗节间膜内表皮层减少,使得整个表皮层结构变薄。(5)LmAbd-1和LmAbd-6对飞蝗产卵行为的影响利用上述RNA干扰方法,注射dsRNA干扰目标基因后(3组平行实验:LmAbd-1RNA干扰,LmAbd-6 RNA干扰,LmAbd-1和LmAbd-6 RNA双干扰),将蜕皮至成虫的雌性飞蝗放入带有视频监控系统的培养箱中继续正常饲养,同时放入相同数量的正常雄性飞蝗成虫,设置dsGFP对照实验,观察记录飞蝗节间膜延展、交配、伸入土下次数及产卵时间等行为数据,统计单位时间内雌性成虫腹部伸入土中次数以及伸入土中产卵时间;待产卵结束后,分别统计3个平行实验组和对照组土中卵囊数及卵粒数,并解剖雌虫,统计腹部中残留卵粒数。结果显示,与对照组相比,分别沉默LmAbd-1和LmAbd-6后,飞蝗腹部伸入土下的次数显著增加,而每次伸入土下的时间显著缩短,飞蝗所产的卵囊个数及卵粒数均显著减少,未正常产出的卵囊仍存留在飞蝗卵巢。本文通过对雌雄飞蝗节间膜差异表达的基因LmAbd-1和LmAbd-6的分子特性、表达特性、雌性飞蝗节间膜结构以及依赖于节间膜延展性的产卵行为的研究,旨在筛选蝗虫防治新分子靶标,从而为蝗灾有效治理提供新的思路和方法。