柠檬烯对单增李斯特菌抑菌活性和机制研究及其应用

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食源性病原微生物是影响全球食品安全和人类健康的主要因素之一。柠檬烯是一种具有良好抗菌活性的单萜类化合物,然而柠檬烯对单增李斯特菌的抑菌活性和抑菌机理研究较少。本文主要研究了柠檬烯对单增李斯特菌的抑菌活性、细胞壁和细胞膜、能量代谢、呼吸代谢以及对呼吸链的影响,揭示了柠檬烯对单增李斯特菌的抗菌机理;同时将柠檬烯应用在冷鲜肉中,对今后柠檬烯作为安全、天然、无毒的新型天然防腐剂的开发和利用奠定了理论基础。本文将柠檬烯作用于单增李斯特菌,通过测定扫描电镜、AKP活性、PI荧光染色、电导率,核酸和蛋白质的泄露来评估其对单增李斯特菌细胞形态和结构的影响。通过测定ATP和ATP酶活性探索柠檬烯对单增李斯特菌能量代谢的影响。通过测定膜电位、呼吸代谢活力变化评估单增李斯特菌呼吸功能变化;通过采用氧电极测定呼吸抑制试验从而确定柠檬烯呼吸抑制途径,并测定主要抑制途径呼吸关键酶来探索柠檬烯对单增李斯特菌呼吸代谢的影响。通过测定呼吸链差异蛋白变化探索柠檬烯对单增李斯特菌呼吸链的影响,并探究柠檬烯在单增李斯特菌呼吸链上的可能抑制位点。其次,将柠檬烯应用于冷鲜肉中,通过挥发性盐基氮,硫代巴比妥酸值,菌落总数、核磁成像、感官评价探究其作用效果。结果如下:(1)柠檬烯对单增李斯特菌具有显著的抑制活性,其抑制单增李斯特菌的最小抑制浓度为20 m L/L,生长曲线结果证明柠檬烯可以有效的抑制单增李斯特菌生长和繁殖。(2)柠檬烯作用于单增李斯特菌细胞壁和细胞膜后,细胞内AKP酶、核酸和蛋白质发生泄漏,电导率上升,柠檬烯可穿透破损细胞与胞内核酸物质结合并在荧光显微镜下发出红色荧光,这表明菌体细胞形态发生严重破坏,细胞壁和细胞膜损伤,细胞壁和细胞膜通透性增强。(3)Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase酶活性对照组和实验组总体均呈下降趋势。随着1 MIC柠檬烯的加入,Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活性被抑制,ATP含量明显降低,ATPase活性紊乱,表明柠檬烯可通过抑制能量代谢从而阻碍ATP的合成。(4)柠檬烯作用于单增李斯特菌后,呼吸代谢活力显著降低,膜电位显著增加,证明柠檬烯抑制了单增李斯特菌的呼吸代谢。呼吸抑制试验证明柠檬烯主要通过抑制单增李斯特菌三羧酸循环(TCA)途径抑制呼吸代谢,其次是糖酵解(EMP)途径。此外,柠檬烯处理单增李斯特菌后,PK活性先上升后下降,SDH活性先降低后升高后降低,MDH活性显著降低,总体上,柠檬烯处理组SDH、MDH和PK活性显著低于实验组,这说明呼吸代谢途径关键酶活性受到抑制。最后,呼吸链复合物活性的降低以及呼吸链蛋白质的差异表达证实柠檬烯通过抑制呼吸链复合体的功能影响呼吸和能量代谢,并且柠檬烯作用于单增李斯特菌呼吸链的可能存在于NADH向辅酶Q传递的过程中。(5)经1 MIC柠檬烯处理后的肉样在第2-10 d,挥发性盐基氮值和硫代巴比妥酸值显著低于对照组,表明柠檬烯可能延缓了蛋白质分解以及具有一定的抗氧化作用。菌落总数的增加、核磁成像结果以及感官评价结果证明柠檬烯可以延缓冷鲜肉的腐败变质。
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