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牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells DPSCs)的概念是由Shi S和Gronthos S于2000年提出来的。认为它们是存在于牙髓组织中具有干细胞性质的未分化间充质细胞，具有多向分化潜能，可形成功能性的成牙本质细胞和牙本质。DPSCs相继在成年牙髓及乳牙残髓中被发现。这个概念的提出，是对从前所谓牙髓“前体细胞”性质的进一步认识，为成体干细胞的研究增添了新的内容，并使牙齿组织工程有了突破性进展。2000年7月，一项由NIH资助的利用DPSCs组织工程化牙齿的技术获得成功，并取得专利。 但是，同其它组织干细胞一样，DPSCs体外培养也会逐渐失去自我更新能力，发生老化。同时由于缺乏特异性标志，目前还无法实现DPSCs的体外纯化，所以DPSCs作为组织工程种子细胞难以大量扩增培养的问题尤为突出。对干细胞进行基因改造，保持其在体外的自我更新能力，是解决的思路之一。 在细胞增殖和分化研究领域，Notch信号途径近年来备受关注。作为一种进化保守性细胞间相互作用机制，Notch信号途径对多种细胞的增殖、分化和凋亡过程都有影响。该信号途径最根本，也是最重要的作用体现在：其介导的侧抑制作用(Lateral第四军医大学博士学位论文inhibition)可使细胞谱系特异性基因表达受阻，从而使细胞保持未分化状态。最近有人提出利用Notch信号的这种“分化抑制作用”，对干细胞的增殖和分化进行调控的设想，并在造血干细胞研究方面取得了一些令人鼓舞的结果。例如:研究人员将活化形式Notch受体导入造血千细胞，使其获得了细胞因子依赖性的“永生”;另外，Notch的配体Delta、Jagged具有类有丝分裂因子作用，可保持造血干细胞的自我更新能力，促进其体外增殖。 目前，Notch信号对DPSCs是否也有类似作用尚不明确。既往研究显示:早在牙齿发育期，Notchl就表达于颈环星网状层的干细胞中，是其保持干细胞性质的重要机制;Notch一Delta信号还与成釉细胞、成牙本质细胞分化有关，被认为是牙齿发育细胞分化多样性的原因之一;另外，目前己明确与牙胚细胞分化有关的生长因子如TGF日、FGF、BMPs等均可诱导Noteh受、配体的表达。因此，有学者推测Notch信号在DPSCs自我更新和分化过程中很可能扮演重要角色，通过它对DPSCs进行调控具有很大的可行性，但目前尚缺乏足够的实验证据。本研究拟在分离鉴定人牙髓干细胞的基础上，采用逆转录病毒基因转导技术，将Notch配体一Deltal基因导入该细胞，探讨Deltal对DPSCs增殖、分化的影响，并对此基因转导细胞作为组织工程种子细胞的可行性进行初步探索，主要实验方法和结果如下: 1.人牙髓干细胞的体外分离、培养和鉴定: 参照并改进文献报道的方法，从成人健康阻生齿中取得牙髓，采用酶消化法分离获得牙髓干细胞，进行原代培养及传代培养。 从以下三个方面对牙髓干细胞进行鉴定: ①细胞克隆形成能力:DPses eFu一F计数为2一1 sclones八03 cell; ②细胞的免疫表型:免疫组化及RT一PCR结果显示细胞vimentin(干细胞标志之一)、I型胶原(牙本质基质主要成分)、GFAP和nestin(神经峭来源标志)、ALK和osteoealein(钙化组第四军医大学博士学位论文织标志)表达阳性;而无或极少MyoD(肌细胞标志)、P队RY(脂肪细胞标志)和DSPP(成牙本质细胞标志)的表达; ③细胞的多向分化能力: 成脂诱导一以100卜g/ml叫噪美辛+10协g/ml胰岛素+0 .smMIBMx+l林M Dex诱导3w，细胞出现脂肪细胞标志蛋白ppAR丫、LPL的表达;sw细胞内有油红O染色阳性脂滴形成; 成肌诱导一经1印MS-氮杂胞营诱导，分别在24一48h、15d左右和21d出现肌细胞标志蛋白MyoD、desmin及myosin的表达，约18d左右可见有粗大的肌管样细胞形成。 成牙本质诱导一nPses在IMnM+loo，OFBs+lommolzLp一甘油磷酸钠+50林g/ml vitC+l onmol/L Dex诱导液中连续培养，部分细胞可出现复层生长，形成细胞结节并钙化，25d左右结节区钙质染色阳性，细胞有成牙本质细胞标志蛋白DSPP表达。 上述结果提示，本实验分离培养的细胞在体外具有一定的克隆形成能力，其表面分子的表达情况与文献报道相似，一定条件下部分细胞可被诱导向脂肪、肌细胞和成牙本质细胞方向分化，具有可塑性，符合干细胞的特征。 2.oe!t。1一〔G「P双顺反子逆转录病毒表达载体的构建、体外包装和重组病毒液的制备: 采用基因重组技术构建Deltal一EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体pDeltal一IRES一EGFP，EGFP作为Deltal表达的报道基因;电穿孔法将重组载体分别转入单、双嗜性包装细胞GP+E86和队317，经嘿吟霉素(puromyein)筛选，得到阳性表达克隆;各选取其中滴度最高的病毒生产细胞，“乒乓球”法提高重组病毒滴度至9.7 x 105cFu/ml;重组病毒感染NIH3T3细胞，倒置荧光显微镜可观察到细胞胞浆内明亮的绿色荧光，RT一PCR结果显示细胞Deltal mRNA表达显著升高。 Dehal一IRES一EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的成功构建第四军医大学博士学位论文和高滴度重组病毒液的获得，为下一步对DPSCs进行基因改造打下良好的基础。 3.De!tal对牙髓干