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研究背景与目的肝衰竭是一类起病较急且病情严重的肝脏疾病,它会导致肝细胞的大量死亡,最终引起多个器官的功能失调和衰竭。它的发病机制非常复杂,主要包括直接的肝脏损伤和不同病原刺激所引起的免疫调节损伤两部分。而固有免疫调节引起的损伤在肝衰竭中发生的很早,因此是肝衰竭发生的重要原因之一。肝脏巨噬细胞是一类定植于肝脏中的特殊巨噬细胞,它是固有免疫调节系统中的重要组成部分,在许多肝脏疾病所引起的肝脏炎症中具有重要调节的作用。然而,肝衰竭发病过程中,肝脏巨噬细胞的具体调节机制尚不明了。本课题旨在研究肝衰竭早期,肝脏巨噬细胞中免疫状态改变对肝衰竭发病影响,阐明促炎因子IL-1β的产生原因及作用,探究肝脏巨噬细胞中相关microRNA分子对肝衰竭早期肝脏巨噬细胞的调控作用,从而进一步理解肝衰竭中固有免疫损伤调节的具体机制,为寻求有效治疗方法提供理论依据。研究方法1.肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞免疫状态改变的影响和产生IL-1p的原因1.1肝脏巨噬细胞免疫状态动态变化：通过ConA处理建立小鼠肝衰竭模型,在ConA处理1,3,6小时后,分离出小鼠肝脏巨噬细胞。RT-PCR检测M1型代表分子IL-1β,M2型代表分子Argl、Mrc2的mRNA表达水平。1.2IL-1β的产生原因：在ConA处理1,3,6小时后,分离出小鼠肝脏巨噬细胞。RT-PCR检测炎性小体分子AIM2的mRNA表达水平；Western blot检测AIM2的蛋白质表达水平。分离正常小鼠的肝脏巨噬细胞,转染AIM2-siRNA及对应的阴性对照,ConA (5μg/ml,下同)刺激1,3,6小时后,ELISA检测IL-1β的表达水平。2.肝衰竭早期阶段,相关microRNA分子调控肝脏巨噬细胞的机制研究2.1筛选合适的microRNA:在ConA处理1,3,6小时后,分离出小鼠肝脏巨噬细胞。RT-PCR检测microRNA-155和microRNA-223的表达水平。2.2microRNA-223与IL-1β的关系：分离正常小鼠的肝脏巨噬细胞,分别转染microRNA-223模拟物和microRNA-223抑制子及对应的阴性对照,ConA刺激1,3,6小时后,ELISA检测IL-1β的表达水平2.3microRNA-223与AIM2的关系：分离正常小鼠的肝脏巨噬细胞分别转染microRNA-223模拟物和microRNA-223抑制子及对应的阴性对照：ConA刺激1,3,6小时后,RT-PCR检测炎性小体分子AIM2的mRNA表达水平；Western blot检测AIM2的蛋白质表达水平。转染AIM2-siRNA及对应的阴性对照,ConA刺激1,3,6小时后,RT-PCR检测microRNA-223的表达水平。共转染荧光报告质粒,空质粒和microRNA-223及对应的阴性对照,检测荧光的强度值。研究结果1.肝脏巨噬细胞免疫状态动态变化：肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞活化后呈现出免疫状态的动态改变。由促炎状态转为抑炎状态,最终又转为促炎状态的表现。2.IL-1β的产生原因：肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞内的IL-1β的产生与炎性小体分子AIM2有关。AIM2的表达被siRNA抑制后,Il-1β的产生量明显减少。3. microRNA-223与IL-1β的关系：肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞内microRNA-223能抑制IL-1β的产生。MicroRNA-223过表达后,IL-1β的产生明显减少；microRNA-223被抑制后,IL-1β的产生明显增多。4. microRNA-223与AIM2的关系：肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞内microRNA-223能抑制AIM2的表达。MicroRNA-223过表达后,AIM2的表达明显下降；microRNA-223被抑制后,AIM2的表达明显升高。AIM2的表达被siRNA抑制后,microRNA-223的表达没有变化。荧光报告系统检测结果显示AIM2不是microRNA-223的直接靶点。研究结论1.肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞活化后免疫状态的改变,产生大量的促炎因子IL-1β影响肝衰竭的发生。2.肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞IL-1β的产生与AIM2有关。3.肝衰竭早期阶段,肝脏巨噬细胞中microRNA-223能抑制肝脏巨噬细胞中AIM2的表达从而阻碍促炎因子IL-1β的产生并影响肝脏巨噬细胞活化后免疫状态的改变；但AIM2不是它的直接靶位。microRNA-223可能会成为有效治疗肝衰竭的潜在分子