对于禽类,一些大肠杆菌能够通过定植在肠道导致肠内感染,同时也能转移到肠外导致肠外感染,主要感染3～7周龄的雏鸡,临床表现为心包炎、肝周炎、腹膜炎、眼炎等症状,给养鸡业带来了巨大的经济损失。达氟沙星(氟喹诺酮类)和安普霉素(氨基糖苷类)是两种兽医专用广谱抗生素,常用于预防和治疗鸡、猪等动物的革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)引起的感染。目前由于抗生素的长期不规范使用,大肠杆菌的耐药性问题愈发严重。然而国内外尚未建立这两种药物对大肠杆菌的耐药判定标准。本研究旨在通过建立达氟沙星和安普霉素的耐药判定标准,为规范这两种药物在我国兽医临床上的应用提供理论依据。(1)达氟沙星和安普霉素对大肠杆菌的野生型临界值(COWT)的测定本研究从全国各大规模化养鸡场采集并分离鉴定了 1412株鸡源大肠杆菌,采用微量肉汤稀释法测得达氟沙星和安普霉素的最小抑菌浓度(MIC)。达氟沙星在0.125～64 μg/mL浓度范围内的MIC呈双峰分布,峰值分别为0.5μg/mL和8 μg/mL,其中MIC为8μg/mL时细菌有215株,占15.7%,分布最多。达氟沙星对鸡大肠杆菌的MIC50为4μg/mL,MIC90为64μg/mL。而安普霉素在2～256 μg/mL浓度范围中呈单峰分布,峰值为MIC=8μg/mL,此处细菌有828株,占60.7%。安普霉素对大肠杆菌的MIC50为8μg/mL,MIC90为16μg/mL。将两种药物的MIC值转换为Log2MIC,进而采用非线性回归分析、NORMINV和NORMDIST方法建立达氟沙星和安普霉素的COWT分别为4 μg/mL和16 μg/mL。(2)大肠杆菌对达氟沙星和安普霉素的耐药特点分析选择不同MIC值的大肠杆菌,用聚合酶链式反应(PCR)法检测耐药基因与MIC的相关性。结果表明大肠杆菌中达氟沙星耐药基因oqxAB、aac(Ib-cr)、qnrAqnrB、qnrS和qepA基因的阳性率在一定程度上随着MIC值的升高而增大,qnrC和qnrD阳性率为0。同样,安普霉素耐药基因aac(3)-Ⅳ和npmA的阳性率也具有MIC值依赖性。采用微量肉汤稀释法进一步筛选到24株达氟沙星高度耐药菌和16株安普霉素高度耐药菌,并使用纸片扩散法检测这两类菌株对17种抗革兰氏阴性菌常用抗生素的敏感性,结果表明这两类菌株均具有多重耐药性,最低10耐,最高达15～16耐。同时还发现所有的达氟沙星耐药菌株对阿莫西林、氨苄西林、萘啶酸、恩诺沙星、环丙沙星、多西环素、四环素和甲氧苄啶均表现出100%耐药,而对阿米卡星和磷霉素相对较敏感。所有的安普霉素耐药菌株对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、强力霉素、四环素、甲氧苄啶和氟苯尼考均表现出100%耐药。所有安普霉素耐药菌株都对庆大霉素耐药,而对阿米卡星和大观霉素相对较敏感。(3)达氟沙星对大肠杆菌的药效学临界值(COPD)的建立构建大肠杆菌感染鸡动物模型,单次口服给予达氟沙星5 mg/kg后,分别收集不同时间点健康组和感染组鸡的血样和4种肠段(十二指肠、空肠、回肠和盲肠)的肠液,并用高效液相色谱荧光法检测药物浓度。4种肠段的群体药物代谢动力学特点符合二室模型。健康组鸡从十二指肠、空肠到回肠的吸收速率(Ka)、清除率(CL)和分布体积(V)依次下降。而在感染组鸡的肠道中,空肠中Ka和V值最高。与健康组相比,感染组鸡从十二指肠、空肠到回肠,达氟沙星的CL依次降低,且均低于健康组鸡的相应肠段,十二指肠和回肠的Ka显著降低,空肠和回肠中的V增大。健康组和感染组鸡回肠中的F均较高。大肠杆菌078在MH肉汤、回肠液和血浆中的生长曲线的趋势一致。微量肉汤稀释法检测达氟沙星在肉汤、血浆和4种肠液中对大肠杆菌078的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,达氟沙星在MH肉汤和血浆中的MIC均为0.016μg/mL,而在4种肠液中MIC值均比血浆中和MH肉汤中的大,其中空肠液中的MIC值最大(6.4 μg/mL),而在回肠液中的MIC值最小(0.64 μg/mL)。采用平板倾倒计数法,绘制达氟沙星对大肠杆菌078的体外和半体内(回肠和十二指肠)杀菌曲线。达氟沙星的体外和半体内杀菌作用均表现出浓度依赖性,因此可选择PK/PD参数AUC/MIC来制定COPD。综合血浆和4种肠段中达氟沙星的药动学(PK)和药效学(PD)特点,最终采用感染组回肠中的数据建立COPD。使用Winnonlin软件分析血浆和回肠的PK数据,得到达氟沙星在感染组鸡血浆中的平均达峰时间(Tmax)、达峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC24)分别为 1 h,0.38 μg/mL 和 2.06 h·μg/mL;在回肠中的 Tmax、Cmax和 AUC 分别为 2.7 h,18.95μg/mL和261.78 h·μg/mL。进而用Winnonlin软件中Sigmoid Emax模型对回肠的PK/PD数据进行模拟,选择E=-3时AUC/MIC的值为药效学目标。计算得到达氟沙星在回肠中的药效学目标为421.45。最后使用Crystal ball软件对达氟沙星在回肠中的PK/PD数据进行蒙特卡洛模拟,得到不同MIC值下AUC/MIC达到药效学目标的概率,选择达标率大于90%的最大MIC为COPD。即回肠液中达氟沙星对大肠杆菌的COPD为0.54 μg/mL。(4)达氟沙星对大肠杆菌的临床临界值(COCL)的制定本研究中,达氟沙星对鸡的临床治疗试验包括感染组、感染治疗组和1个空白对照组,每组10只鸡。攻毒菌株是通过PCR和雏鸡攻毒实验筛选出的5个不同MIC值的大肠杆菌致病株。每一个感染组对应三个感染治疗组,治疗方案分别为5 mg/kg,2次/天,连续3天;10mg/kg,2次/天,连续3天;20mg/kg,1次/天,连续3天。治疗结果表明,3种治疗方案的治愈率无明显差异。因此,选择5 mg/kg的治疗结果来制定COCL。首先采用EUCAST推荐的WindoW法,得到达氟沙星对大肠杆菌的COCL范围为0.5～16 μg/mL。然后用CART分类树回归分析法分析得到,当POC等于90%时,COCL>2.25μg/mL。因此,推荐4μg/mL为达氟沙星对大肠杆菌的COCL。综上,本研究中达氟沙星的COWT=COcL=4μg/mL,COPD为0.54μg/mL。因此,达氟沙星的耐药判定标准为4 μg/mL。而安普霉素的COWT为16 μg/mL,其药效学和临床临界值还有待进一步研究和确定。