研究背景及目的：肝细胞癌是目前严重危害人类健康的肿瘤之一，目前在所有肿瘤中发病率居第五位，死亡率排在第三位，尤其在中国，乙肝相关的肝硬化导致肝癌发病率极高。目前对于肝细胞癌的治疗方法，以手术切除为主，辅助以放疗、化疗治疗，但是，很多病人在临床诊断时已经失去了手术指征，因此治疗效果不佳、五年生存率不高，亟需找到安全、有效的治疗方法。有报道表明抗凋亡Bcl-2家族成员的过表达与肝癌病人的分级、预后以及治疗抵抗密切相关，是治疗肝细胞癌的重要靶点。Bcl-2家族是一类调控细胞存活与程序性死亡的蛋白家族，家族成员主要分为三个亚类，抗凋亡的Bcl-2家族成员(Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Bcl-w，A1等)、促凋亡的BH3样蛋白(Bim，Noxa，Puma，Bid，Bad等)和凋亡过程的执行者(Bak，Bax)，三类蛋白之间相互作用的平衡对于维持细胞的的稳态以及存活状态十分重要。针对Bcl-2抗凋亡家族成员的功能和结构特点，目前已开发出一系列天然或人工合成的小分子化合物抑制剂，它们通过与促凋亡成员竞争性结合抗凋亡家族成员，释放促凋亡的Bak、Bax或BH3样蛋白，诱导凋亡的发生。多种Bcl-2靶向抑制剂相继进入了临床I~III期实验，在多种肿瘤尤其是白血病和非小细胞肺癌的单药治疗以及联合用药中都显示出了良好的治疗前景。有研究表明，一些类型的肿瘤对Bcl-2抑制剂并不敏感，易发生耐药，肝细胞癌便是其中的代表之一。但目前对导致肝细胞癌中Bcl-2抑制剂抵抗的原因及机制尚不清楚，可能的原因为Mcl-1的上调、保护性自噬的诱导以及凋亡相关基因的缺失等。本研究以肝细胞癌细胞株为模型，主要目的是探究Bcl-2抑制剂在肝癌细胞中发生抵抗的分子机制，并通过阐明相关的抵抗机制来制定有效的增敏策略，从而使得Bcl-2抑制剂能够有效地杀伤肝癌细胞以达到较好的临床疗效。主要研究内容：第一部分Bcl-2/xL抑制剂ABT-263在肝癌细胞中上调Mcl-1的分子机制研究1.验证Mcl-1上调是否是导致肝癌细胞对ABT-263抵抗的机制；2.检测ABT-263处理肝癌细胞后Mcl-1分子的mRNA和蛋白水平；3.通过荧光素酶报告基因实验验证ABT-263是否活化了Mcl-1的基因转录，通过RNA稳定性实验验证ABT-263是否增加了Mcl-1mRNA的稳定性；4.利用Western blot检测Mcl-1相关磷酸化位点的磷酸化水平，结合激酶相关通路的抑制剂探究其是否能够影响Mcl-1的表达水平；5.通过CCK-8、台盼蓝染色、流式细胞仪计数等功能学实验验证相关通路的抑制剂能否增敏ABT-263杀伤肝癌细胞的作用。第二部分Bcl-2/xL抑制剂ABT-737在肝癌细胞中诱导保护性自噬的分子机制研究1. ABT-737在处理肝癌细胞时，Bcl-2表达水平的不同是否会导致肝癌细胞对ABT-737敏感性的差异；2.探究ABT-737在高表达Bcl-2的肝癌细胞中诱导保护性自噬的分子机制。第三部分Bcl-2抑制剂左旋棉酚杀伤肝癌细胞的增敏措施及相关分子机制研究1.验证Hsp90抑制剂17-AAG是否能够增敏左旋棉酚杀伤肝癌细胞的作用；2.17-AAG增敏左旋棉酚的分子机制探究，是否通过抑制保护性细胞自噬；3.17-AAG抑制保护性自噬的机制是否通过影响自噬关键蛋白的稳定性；4.17-AAG抑制保护性自噬和部分逆转Mcl-1表达上调的机制是否是通过抑制ERK的活化；5. PI3K/mTOR双抑制剂BEZ-235增敏左旋棉酚杀伤肝癌细胞的分子机制研究。主要研究方法：1.肝癌细胞系PLC/PRF/5, Hep3B, HepG2和Huh7的体外培养及传代；2. qPCR和Western blot检测相关分子mRNA和蛋白的表达水平；3.通过瞬时转染siRNA或者过表达质粒的方法可以实现基因的敲低或过表达；4.荧光素酶报告基因实验和RNA稳定性实验探究ABT-263上调Mcl-1mRNA的分子机制；5.蛋白合成抑制实验和Western blot来探究ABT-263上调Mcl-1蛋白水平的分子机制；6. CCK-8，台盼蓝计数以及流式细胞计数检测细胞的生长抑制、细胞死亡以及凋亡情况；7.通过荧光显微镜观察不同处理因素后胞内GFP-LC3小点的聚集情况，进而反映细胞内的自噬水平；8.免疫共沉淀实验检测蛋白之间是否存在可能的相互作用。主要研究结果：1. ABT-263诱导Mcl-1表达上调是肝癌细胞对其抵抗的重要机制；2. ABT-263可以通过增加Mcl-1的mRNA稳定性来使其表达上调，同时ABT-263还可以通过以下两个主要通路增加Mcl-1蛋白的稳定性：通过活化ERK和JNK促进Mcl-1Thr163磷酸化水平增加蛋白的稳定性，通过活化Akt进而抑制GSK-3β的活性来减少Mcl-1蛋白的降解；3. ERK、JNK以及Akt相关通路的抑制剂可以增敏ABT-263对于肝癌细胞的杀伤作用；4. ABT-737在高表达Bcl-2的肝癌细胞系中可以通过ROS的产生进而诱导保护性的细胞自噬，导致耐药的发生；5.17-AAG和BEZ-235能够增加左旋棉酚对于肝癌细胞的杀伤作用；6.17-AAG通过抑制ERK的活化，而不是影响自噬关键蛋白的稳定性来部分逆转左旋棉酚介导的保护性自噬；7.17-AAG和BEZ-235分别通过抑制ERK以及mTOR的活化进而部分逆转左旋棉酚介导的Mcl-1表达上调。结论：肝癌细胞通过上调Mcl-1的表达水平以及诱导保护性细胞自噬来抵抗Bcl-2抑制剂，ERK、JNK、Akt等通路抑制剂及17-AAG可通过抑制相关的抵抗机制而增敏Bcl-2抑制剂的抗肿瘤作用。