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研究背景:环境胁迫包括环境毒素、寡营养、极端温度、高盐、紫外线、辐射和污染物等,均会引起细菌胞内产生、积累活性氧类物质（reactive oxygen species,ROS）,造成氧化应激。调整细胞内氧化-抗氧化稳态是微生物应对环境胁迫的重要机制之一。近年来研究发现生物膜的形成也是微生物防御外界不利因素的机制,并与上述氧化-抗氧化稳态机制相关联。目前,环境胁迫相关报道多聚焦在人和动物病原微生物,而对环境微生物鲜有涉及。众所周知,环境微生物是驱动地球元素循环的重要力量,在复杂多变的地质环境下,微生物在改造环境的同时,其生理生化过程、种群演变、生态功能均发生着适应性变化,共同维持着地质环境与生物系统的共演化。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida,P.putida）能在多种污染环境中生存,提示该种属菌可能具有一些高度保守的基因,编码分解代谢途径的关键蛋白和相关酶,并利用完善的防御机制应对环境胁迫。P.putida MnB1是研究较为深入的锰氧化细菌,它可氧化环境中低价锰而获取能量,并参与氧自由基清除、生物膜形成等生物学过程。因此,本文重点研究环境因素如二价锰（Mn（Ⅱ））、氧胁迫（H2O2）对P.putida MnB1生长、营养底物获取、氧化-抗氧化稳态及生物膜形成的影响,以期揭示环境微生物适应环境、防御环境胁迫的可能分子作用机制。研究目的:MnCl2和H2O2对P.putida MnB1生物膜形成的影响及机制初探,以揭示生物膜在环境微生物适应、防御环境胁迫中的作用。实验方法:取自然环境中存在的浓度Mn2+（40-5000μM）和H2O2（40-1000μM）分别作用于纯培养体系的P.putida MnB1。利用浊度法观察MnCl2和H2O2对细菌生长的影响。采用结晶紫法、扫描电镜（scanning e1ectron microscope,SEM）、激光共聚焦方法（confoca1 1aser scanning microscopy,CLSM）等,观察、定量分析MnCfl2和H2O2对P.putida MnB1生物膜形成的影响。使用结晶紫法分析抑制剂鸟嘌呤核苷三磷酸（guanine triphosphate,GTP）对生物膜形成的影响。基于同源模式菌P.putidaGB-1的全基因序列,扩增P.putidaMnB1目标基因多铜氧化酶（multicopper oxidase,Mco）、锰转运蛋白（manganses ABC transporter,nABC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,Sod）、入谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,Gr）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase,Pde）等,通过核酸序列及编码蛋白质比对验证目标基因。基于实时荧光定量Q-PCR分析,查明目标基因在P.putida MnB1浮游和成膜状态中的表达差异,揭示MnC12对Mco、MntABC、Sod、Pde基因表达的影响以及H2O2对Sod、Gr、Pde基因表达的影响。研究结果:40-5000μMMnCl2促进P.putida MnB1的生长并抑制生物膜的形成。Mco基因的表达在浮游和成膜菌体中无显著性差异,且不响应外源MnCl2的加入。外源MnCl2促进MntABC基因表达上升。外源MnCl2逆转了成膜过程中Sod基因表达大幅升高的趋势,随着培养的进行,Sod基因表达水平显著降低。外源MnC12显著促进成膜中期Pde基因的表达。40-1000 μMH2O2对P.putida MnB1细胞无明显杀伤作用,仅1000 μM组细菌生长在24小时内受到阻滞。P.putidaMnB1可以快速分解H2O2,6小时内不同起始浓度H2O2全部降解。结晶紫法检测、SEM和CLSM观察均表明H2O2促进早期生物膜的形成。H2O2对稳定期生物膜的Gr基因表达具有一定的抑制作用,显著下调成膜中期Sod基因表达。Pde基因表达在成膜初期、早期、中期和成熟期均显著变化,成膜初期和早期H2O2显著下调Pde基因表达,中后期得以逆转并大幅升高。结论:外源MnCl2促进P.putida MnB1的生长及对二价锰的获取,伴随胞内氧化应激水平的下降,及生物膜形成的抑制,初步证实环境有利因素对生物膜的形成具有负调控作用。H2O2促进P.putida MnB1生物膜的形成,伴随胞内氧化应激水平的上升,进一步证实生物膜的形成是P.putida MnB1抵御不利环境因素的关键机制,其中Pde基因可能发挥着关键作用。同时,P.putidaMnB1生物膜的形成是响应环境因素的首要机制,其敏感性强于胞内氧化-抗氧化稳态系统。