【摘 要】
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目的:观察冠通方对于颈总动脉球囊损伤后大鼠的TGF-β1/Smad信号转导通路中Smads蛋白的影响,探讨冠通方预防再狭窄的形成的机制,为中医药防治再狭窄提供新的方向。方法:将180只Wistar雄性大鼠,按照随机数字表法,分为正常组、模型组、假手术组、冠通方组、化瘀拆方组、祛痰拆方组6组,每组再分成三个亚组:1天、7天、28天3个亚组。每组10只大鼠。在行颈总动脉球囊损伤术的前4天至处死前,冠通
【基金项目】
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2015年国家自然科学基金项目（项目批准号:81560748）；
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目的:观察冠通方对于颈总动脉球囊损伤后大鼠的TGF-β1/Smad信号转导通路中Smads蛋白的影响,探讨冠通方预防再狭窄的形成的机制,为中医药防治再狭窄提供新的方向。方法:将180只Wistar雄性大鼠,按照随机数字表法,分为正常组、模型组、假手术组、冠通方组、化瘀拆方组、祛痰拆方组6组,每组再分成三个亚组:1天、7天、28天3个亚组。每组10只大鼠。在行颈总动脉球囊损伤术的前4天至处死前,冠通方组、化瘀拆方组、祛痰拆方组大鼠,应每日灌服与体重相对应剂量的中药煎液;模型组球囊损伤后不予干预;假手术组仅切开颈外动脉,不予球囊损伤;正常组不做任何干预。使用光镜观察HE染色切片与透射电子显微镜观察各实验组的血管形态改变,对比验证造模是否成功;使用ELISA法检测血清IL-6、ET-1含量;Western blot与RT-PCR检测颈总动脉组织中Smad2、Smad4、Smad7的m RNA水平及蛋白表达水平。结果:1.HE染色:光学显微镜观察可见正常组、假手术组与28天冠通方组管腔通畅,形态无差异。28天拆方组血管形态基本完整,但仍有炎症浸润与平滑肌水肿。28天模型组管腔狭窄。2.电镜:透射电镜下,正常组、假手术组超微结构几乎无差异;1天冠通方组内皮增生,7天冠通方组平滑肌细胞结构清晰、细胞核排列规则、拥有完整的线粒体,28天冠通方组可见新生小血管;1天模型组平滑肌结构不清晰、肌丝断裂,7天模型组平滑肌细胞坏死、细胞核不规则、线粒体呈空泡样,28天模型组内质网扩张,线粒体嵴消失、空泡化,细胞组织坏死,细胞核即将凋亡,周边空泡样变。2.IL-6、ET-1含量:对比正常组大鼠,假手术组与28天冠通方组与28天化瘀组IL-6、ET-1含量无统计学差异（P＞0.05）,其余各组IL-6、ET-1含量均高于正常组（P＜0.01）。模型组大鼠血清IL-6含量最高,对比正常组、假手术组和药物治疗组,具有统计学意义（P＜0.01）。观察1天、7天、28天动态发现,其中7天模型组IL-6、ET-1含量最高,对比正常组、假手术组均具有统计学意义。模型组的IL-6、ET-1含量趋势:1天组升高,7天组升高到峰值,28天组逐渐下降。对比模型组,药物治疗组1天、7天、28天的IL-6、ET-1含量,呈逐渐下降的趋势,差异对比显著,具有统计学意义（P＜0.01）。3.Smad2、Smad4、Smad7的m RNA与蛋白水平:（1）对比正常组大鼠,假手术各和28天冠通方组大鼠Smad2、Smad4的m RNA与蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。除假手术组外,各组Smad2、Smad4的m RNA与蛋白表达均高于正常组（P＜0.01）。模型组Smad2、Smad4的m RNA与蛋白表达最高,对比正常组、假手术组和药物治疗组,具有统计学意义（P＜0.01）。观察1天、7天、28天动态发现,其中28天模型组Smad2、Smad4的m RNA与蛋白表达最高,对比正常组、假手术组均具有统计学意义（P＜0.01）。模型组Smad2、Smad4的m RNA与蛋白表达,随1天、7天、28天动态逐渐升高;而各治疗组Smad2、Smad4的m RNA与蛋白表达在第一天升高,随着1天、7天、28天动态趋势逐渐下降。差异对比显著,具有统计学意义（P＜0.01）。（2）对比正常组大鼠,假手术各和28天冠通方组大鼠Smad7的m RNA与蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。除假手术组外,各组Smad7的m RNA与蛋白表达均低于正常组（P＜0.01）。模型组大鼠Smad7的m RNA与蛋白表达最低,对比正常组、假手术组和药物治疗组,具有统计学意义（P＜0.01）。观察1天、7天、28天动态发现,其中28天模型组Smad7的m RNA与蛋白表达最低,对比正常组、假手术组均具有统计学意义（P＜0.01）。模型组Smad7的m RNA与蛋白表达,随1天、7天、28天动态逐渐降低;而各治疗组Smad7的m RNA与蛋白表达在第1天降低,第7天降低到峰值,28天逐渐升高。对比第1天模型组与拆方组（祛痰组、化瘀组）的结果,发现Smad7的m RNA与蛋白表达差异并不显著,但从第7天开始,拆方组与模型组的差异对比显著,具有统计学意义（P＜0.01）。结论:1.本研究验证冠通方及其拆方可以干预大鼠颈总动脉球囊损伤术后再狭窄的形成。全方组的干预效果最好。说明冠通方及其拆方能抑制炎症反应,通过调控TGF-β1/Smad通路中的Smad蛋白,抑制平滑肌的迁移和增生,延缓纤维化的形成,促进血管新生,保护血管形态与内皮功能,对于PTCA术后引起的再狭窄有预防作用。2.拆方研究表明,全方组干预效果优于拆方组,证明全方中的化瘀药协同祛痰药,通过预防痰瘀互结的形成,来防治PTCA术后再狭窄;对比拆方组之间的结果,化瘀组效果优于祛痰组,提示再狭窄的主要病机在于手术机械损伤后引起的血瘀。
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