论文部分内容阅读
糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症之一,其患病人群逐年增加,但尚欠缺公认的特效治疗方法。中医药在防治糖尿病肾病方面积攒了丰富经验且具有很大优势,但其成分众多、机制复杂,缺少整体性、系统性的药理研究,一定程度上限制了中医药的开发与应用。随着系统生物学、多向药理学等多个学科领域的兴起与交叉融合,运用新技术探索中药复方的药效机制成为可能。因此,本文通过数据分析方法发掘治疗糖尿病肾病的核心方,并应用网络药理学技术从生物网络视角着眼,对核心方的作用机制进行研究,以期为进一步的实验研究提供导向。目的:首先,通过对治疗糖尿病肾病的中药处方的用药规律进行分析,以找寻治疗糖尿病肾病的核心方;其次,运用网络药理学技术,以从整体性、系统性角度探究核心方治疗糖尿病肾病的作用机制。方法:本研究从广东省中医院住院部系统导出糖尿病肾病患者资料,收集符合纳入标准的患者的首次住院病案的中药处方及相关信息。根据基线肾小球滤过率和慢性肾脏病分期标准将处方分为A、B、C、D四组,各组所对应的肾小球滤过率分别为≥90 ml/(min.1.73m2),60-89ml/(min.1.73m2),30-59ml/(min.1.73m2),15-29ml/(min.1.73m2)。首先对中药处方的证型分布进行统计;其次,分别进行总体样本和分组样本的中药频次统计,并将高频中药进行聚类分析;再次,对总体样本的高频中药进行Apriori关联规则分析,通过以上多种方法分析治疗糖尿病肾病处方的配伍规律和筛选出核心方。根据上述结果,在TCMSP平台中寻找核心方的所有已知成分,并将口服生物利用度(?)30%和类药性(?)0.18的中药成分筛选为潜在活性成分,再次在TCMSP平台上寻找潜在活性成分的作用靶标,构建潜在活性成分及其对应靶标数据集。在TTD、GAD、DRUDGBANK、OMIM等疾病靶标相关数据库中检索相关靶标,构建DKD靶标数据库。从蛋白质互相作用信息数据库String数据库中获得成分作用靶标和DKD疾病靶标间相互作用的信息数据。将以上信息导入Cytoscape3.6.1构图软件中,构建活性成分、成分作用靶标、DKD疾病靶标间相互作用的可视化的PPI网络模型,对网络模型的拓扑参数进行分析,筛选出网络中的关键靶标和化合物,紧接着,将成分作用靶标和DKD疾病靶标的共同靶标和中药作用的关键靶标进行KEGG通路富集分析,运用Omicshare对KEGG通路富集分析结果进行可视化处理,以预测治疗DKD的核心方的主要作用机制。结果:本研究一共纳入了 271个中药处方,对中药处方证型进行统计,发现本次纳入的处方证型本虚证中主要包括要脾肾气虚证、脾肾阳虚证、气阴两虚证等,而其中脾肾气虚证约占所有处方证型的67.5%;标实证中主要包括血瘀证、湿热证、水湿证等,而其中血瘀证约占所有处方证型的97%。中药频次统计分析,发现黄芪、党参、白术、茯苓、丹参、盐菟丝子、山药、桃仁8味中药是总体样本和各组样本的高频中药的前8味。DKD四组有25味相同高频中药,按功效可简单归类为健脾益气类、补肾类、活血化瘀类、利水祛湿类等。此外,各组独有高频中药归类中,A、B组以滋肾补肝类和清阴虚热类为主;C、D组以行气通络类和补肾阳泄浊类为主。在中药聚类分析中,A、B、C、D四组高频中药各分5、2、5和2类,总体高频中药聚类分析共得到2类中药组合,第1类组合茯苓、丹参、党参、盐菟丝子、山药、黄芪、白术,第2类组合其他药物。总体高频中药的关联规则分析显示,不断提升支持度、置信度、提升度后,可以得到8组四阶关联规则药物组合:黄芪或党参、桃仁、盐菟丝子、白术;桃仁、山药、白术、黄芪;盐菟丝子、党参、黄芪、白术;桃仁、盐菟丝子、茯苓、白术;制何首乌、茯苓、白术、黄芪;盐菟丝子、党参、丹参、白术;桃仁、党参、白术、黄芪。根据数据挖掘结果,结合文献查阅和临床经验,拟定治疗DKD脾肾气虚,湿疲阻络证型的核心方:黄芪、人参、盐菟丝子、山药、茯苓、白术、丹参、桃仁。本研究通过TCMSP平台预测了黄芪、人参、菟丝子、山药、茯苓、白术、丹参、桃仁8味中药的126个活性成分及其对应的261作用靶标,在TTD、GAD、DRUDGBANK、OMIM疾病基因数据库中寻找到109个糖尿病肾病疾病靶标,并在Srting数据库中获得了由327个靶标组成的6487对靶间相互作用信息的数据,随后建立了“中药成分作用靶标—DKD疾病靶标”PPI网络模型和“中药成分-成分作用靶标—DKD疾病靶标”PPI网络模型。通过分析“中药成分-成分作用靶标—DKD疾病靶标”PPI网络中节点的Degree值,其中Degree值排名前6的中药活性成分依次是槲皮素、山奈酚、木犀草素、7-0-甲基异丁草胺、丹参酮、鼠尾草酚酮、豆留醇。通过分析“中药成分作用靶标—DKD疾病靶标”PPI网络模型的拓扑参数筛选到69个关键靶标,其中包括44个仅源于中药成分作用的靶标,25个DKD疾病靶标和14个共有靶标,DC值(?)120的关键靶标,依次是 AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、MAPK1、EGFR、CASP3、MAPK8、EGF、MYC、JUN、MMP9、STAT3、CXCL8。使用ClueGO对中药成分与DKD疾病相关的27个共同靶标进行KEGG通路富集分析,获得22条有统计学意义的富集条目,其中包括5条生物通路:HIF-1 signaling pathway、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、Relaxin signaling pathway、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications;其次,对69个关键靶标中中药成分作用的44个关键靶标进行KEGG通路富集分析。富集后获得96条有统计学意义的条目,其中包括29条生物通路,涉及免疫应答、炎性反应、调节细胞功能、糖脂代谢、氧化应激、抗纤维化以及激素调节等。运用Omicshare对KEGG通路富集分析结果进行可视化处理,结合p值、富集基因数目和富集指数,发现 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway 等多条通路可能是核心方治疗 DKD的主要通路。结论:脾肾气虚,湿瘀阻络证型是糖尿病肾病最常见的证型,黄芪、党参、菟丝子、山药、茯苓、白术、丹参、桃仁8味药是治疗糖尿病肾病的核心方。由黄芪、菟丝子、山药、人参、茯苓、白术、丹参、桃仁等8味药组成的核心方,治疗糖尿病肾病的主要起效成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、异黄酮II等,主要靶标包括 AKT1、IL6、VEGFA、TNF、MAPK1、EGFR、MAPK8、EGF、JUN、MMP9、STAT3、CXCL8 等,主要通路包括 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway等。本研究揭示了核心方治疗糖尿病肾病的主要作用机制涉及调节免疫炎症、调节糖代谢、抗氧化应激、抗纤维化以及调节细胞增殖、凋亡等;也体现了核心方治疗糖尿病肾病的多化合物与多靶标主次协调作用的复杂机制。