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禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic Escherichia coli,APEC）是肠外致病性大肠杆菌（Intestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC）的重要成员,是我国禽大肠杆菌病的重要感染病原之一。APEC与新生儿脑膜炎大肠杆菌（Neonatal meningitis Escherichia coli,NMEC）的毒力基因存在高度同源性,随着集约化养殖的发展,APEC已成为一种潜在的人兽共患病原菌,存在感染婴儿并患新生儿脑膜炎的潜在风险,故对该菌的研究具有重要的公共卫生意义。大肠杆菌作为革兰氏阴性菌,可释放一种多功能杀伤性武器—一Ⅵ型分泌系统（Type Ⅵ secretion system,T6SS）,它能通过分泌效应蛋白作为武器攻击靶细胞从而参与致病过程。ClpV是拆解T6SS的元件,且能在三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）的驱动下完成T6SS的回收和组装。目前在大肠杆菌中已发现三套T6SS,T6SS1参与细菌与多种宿主细胞的互作,影响细菌间竞争,增强菌株对小鼠的致病性;T6SS2仅参与菌体与小鼠脑微血管内皮细胞的相互作用;T6SS3则不具备分泌功能。其中T6SS1在大肠杆菌致脑膜炎过程中发挥何种作用尚不清楚。故本研究以T6SS1核心组分ClpV1为切入点,探究其在APEC致脑膜炎时所发挥的作用,从而更好地理解APEC的致病机理。1.TW-XM菌株clpV1基因突变株的构建及生物学特性研究首先设计PCR引物用于扩增检测APEC菌株TW-XM（Wild-type,02:K1）中的clpV1基因,对扩增后的基因产物进行纯化、克隆并测序。依据TW-XM的clpV1基因序列设计缺失引物用于缺失靶基因。缺失引物的5’端分别与clpV1基因两翼序列同源,而3’端则与质粒pKD3上的氯霉素抗性基因cat两翼序列同源。运用λ-Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板,通过缺失引物扩增出含cat抗性片段的PCR产物,将该融合片段导入含有质粒pKD46的TW-XM菌株内,筛选出一次同源重组菌TW-XMΔclpV1∷cat。将质粒pCP20电转导入一次重组菌内,并消除氯霉素抗性基因。最后,依据PCR检测及测序结果分析,确认成功构建clpV1基因缺失株TW-XMΔclpV1。在此基础上,将表达clpV1基因的pBR322质粒电化学转化入TW-XMΔclpV1中,成功构建回补株 TW-XMCΔclpV1。对各突变株进行遗传稳定性检测,证实各菌株均能稳定遗传。随后对各突变株进行生物学特性研究。生长曲线试验显示各菌株生长无明显差异。半固体运动试验结果显示,clpV1基因缺失株在半固体培养基上的运动性相比野生株显著下降（p<0.05）。生物被膜试验表明clpV1基因能显著影响TW-XM生物被膜形成能力（p<0.05）。药物敏感性试验结果显示clpV1基因的缺失不影响TW-XM菌株对临床上常用9种抗生素的敏感性。通过检测clpV1基因突变株主要毒力因子变化,结果显示,与野生株TW-XM相比,clpV1缺失株中Ⅰ型菌毛合成相关基因、T6SS1相关基因以及参与脑膜炎的相关毒力因子的基因转录量显著或极显著下降（p<0.05或p<0.01）。雏鸭致病力试验显示,缺失株对雏鸭的致病力减弱。以上结果提示,clp V1基因参与TW-XM的诸多生物学功能,且在缺失了该基因后,细菌部分毒力因子的转录量下降,导致细菌毒力下降。2.clpV1基因对APEC TW-XM致脑膜炎的影响为研究clp V1基因对TW-XM菌株致新生小鼠脑膜炎能力的影响,试验将野生株TW-XM、缺失株TW-XM△clp V1与回补株TW-XMCΔclpV1,分别以107 CFU/只,接种ICR小鼠腹腔,建立感染模型,并设立空白对照组（腹腔注射0.1 mLPBS）。于感染后12 h,采用血常规、核磁共振、脑脊液检查、组织器官细菌载量、细菌鉴定、Evan’s Blue法、脑部相关炎性因子的表达检测、病理组织学观察和免疫组化法检测小鼠脑部紧密连接蛋白表达等方法进行评价。结果表明:与空白对照组相比,野生株TW-XM处理组小鼠的临床表现、核磁共振和血液学指标异常;小鼠脑脊液中存在大肠杆菌;血液、脑和肺则有大量细菌繁殖;炎性因子检测结果发现,与空白对照组相比,野生株TW-XM感染小鼠,引起脑部IL-1p、IL-6、IL-8和TNF-α基因的表达极显著升高（p<0.01）;脑部Evan’s Blue含量极显著升高（p<0.01）;病理组织学检查发现TW-XM感染组的小鼠脑膜增厚、出血、水肿,大脑皮层崩解坏死且有明显的嗜中性粒细胞浸润;免疫组化法发现,小鼠脑部紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达极显著降低（p<0.01）,以上结果证实野生株TW-XM能够导致小鼠发生脑膜炎,使小鼠脑部发生炎症反应,破坏血脑屏障。而与野生株TW-XM组相比,缺失株TW-XMΔclpV1组小鼠各项指标与空白对照组相比均无显著差异,说明clpV1基因的缺失会减弱野生株TW-XM破坏血脑屏障的能力。综上所述,在缺失E.coli Ⅵ型分泌系统1核心组分ClpV1后,TW-XM菌株的毒力减弱,并减弱了 TW-XM菌株致小鼠脑膜炎的能力。故clpV1基因在TW-XM菌株致脑膜炎过程中扮演重要角色。