第一部分Sirt3在糖尿病大鼠肾组织及高糖环境下肾小管上皮细胞的表达目的:国际糖尿病联盟发布的数据显示,截至到2013年,全球范围内的糖尿病患者已经达到3.82亿,预计到2035年糖尿病患者将高达4.71亿。2013年末,已有510万人死于糖尿病,用于治疗糖尿病的医疗支出高达5480亿美元,而近几年糖尿病的发病率并没有明显下降的趋势,糖尿病已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一,它给整个人类及社会带来了沉重的负担。糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症,并且是引起终末期肾疾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。据报道,40%—50%的1型糖尿病患者伴有肾脏损伤,在2型糖尿病患者中这一数字达到了30%。因此预防糖尿病肾病的发生,阐明糖尿病肾病的发病机制,寻找治疗糖尿病肾病的有效治疗方法已经成为全人类面临的重大课题。糖尿病肾病的发病机制非常复杂,高糖、炎症、缺氧等细胞外刺激导致的糖代谢异常、肾脏血流动力学改变、氧化应激、细胞因子的作用、线粒体功能失调、内质网应激等病理过程都参与了糖尿病肾病的发生与发展。糖尿病肾病的病理特点包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化、肾小管萎缩等,同肾小球一样,肾小管在糖尿病肾病的发病过程中发挥着非常重要的作用,肾小管形态和功能的改变加速了糖尿病早期蛋白尿的发生。线粒体是细胞呼吸和产能的主要场所,它在调节细胞的生存?代谢平衡及死亡方面扮演着非常重要的角色,近些年的研究发现,线粒体结构、功能损伤导致的活性氧(reactive oxygen species,ROS)过量产生在糖尿病肾病的发病过程中发挥着起始与关键性作用。过量的ROS可激活细胞内多条信号通路,触发氧化应激、细胞凋亡、纤维化、炎症等反应,加重糖尿病的肾脏损伤。因此,认识线粒体ROS的产生和清除机制,寻找能够减轻线粒体氧化应激的物质对认识和治疗糖尿病肾病具有重要意义。Sirt3是沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,Sir2)的蛋白同源家族Sirtuins中的一员,它主要定位于细胞中的线粒体,是线粒体内主要的蛋白去乙酰化酶,Sirt3通过调节关键蛋白的乙酰化状态与活性来维持线粒体的正常生理功能,研究表明Sirt3参与线粒体呼吸链反应、三羧酸循环、脂肪酸的β氧化、抗氧化通路等多种反应的调控,它对维持线粒体内氧化状态的平衡具有重要作用。同样,Sirt3在调节细胞能量代谢、氧化应激、细胞凋亡等方面也发挥着重要作用,它可以对抗多种因氧化应激负荷引起的疾病,如:心肌肥大、衰老、肿瘤、心力衰竭、神经退行性疾病、急性肾损伤等等。基于Sirt3对线粒体结构和功能的保护作用,我们推测线粒体Sirt3在糖尿病肾病的发病过程中同样发挥着重要作用,而目前,关于Sirt3与糖尿病肾病之间的研究又非常有限,本部分研究的主要目的是观察Sirt3在糖尿病大鼠肾组织及高糖培养条件下肾小管上皮细胞的表达、分布及改变,初步研究Sirt3与糖尿病肾脏损伤之间的关系。方法:1动物模型的制备及动物标本的收集:将购买自河北医科大学实验动物中心的40只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为两组:一组为对照组(normal control group,NC),一组为糖尿病模型组(diabetes mellitus group,DM),每组20只。两组动物均禁食12小时,DM组大鼠腹腔单次注射1%链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,65 mg/kg),NC组大鼠腹腔注射相应体积的0.1mol/L的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后72小时,尾静脉采血检测大鼠血糖,单次检测血糖水平大于等于16.7 mmol/L且尿糖阳性者(+++~++++)即为糖尿病模型造模成功。NC组和DM组的大鼠随机分为NC8周、NC12周、DM8周、DM12周四组,每组10只。于造模成功后的第8周、12周处死相应组别的大鼠。处死前禁食6~8小时,10%水合氯醛麻醉并称重,股动脉取血用于生化指标的检测:血糖(Blood glucose,BG)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(Serum creatinine,Scr);迅速剥离肾脏,用生理盐水将血液冲洗干净,切取部分肾组织置于4%多聚甲醛溶液中,用于H.E、PAS染色及免疫组化染色;切取部分肾皮质经液氮速冻处理后冻存于-80℃冰箱,用于提取肾组织蛋白及RNA,并运用Western blot和Real-time PCR检测Sirt3的蛋白及m RNA表达。2细胞培养及标本收集:永生化人肾小管上皮细胞(human kidney 2,HK-2)购买自美国模式培养物集存库,细胞培养液为含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基,并置于5%CO2、37℃培养箱中培养,两天进行一次换液,待细胞生长至80%左右时进行传代。实验组HK-2细胞经同步化处理后,分别给予正常糖浓度培养基(normal control group,5.5 mmol/L D-glucose,NG),高渗培养基(mannital control group,5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol,M),高糖培养基(high glucose,30 mmol/L D-glucose,HG)6小时、12小时、24小时、48小时、72小时,并于相应的时间收取细胞用于提取细胞蛋白及RNA,并运用Western blot和Real-time PCR检测Sirt3的蛋白及m RNA表达,细胞免疫荧光染色法检测Sirt3在HK-2细胞的分布及表达。结果:1 H.E和PAS实验结果显示,正常对照组大鼠肾脏组织结构未见明显改变,12周DM组大鼠肾组织可见肾小球体积增大,系膜基质增多,肾小管代偿性肥大;2与正常对照组大鼠相比,8周和12周DM大鼠的血糖、尿素氮、肌酐值均明显增高(P<0.01);3与正常对照组大鼠相比,12周DM大鼠肾脏SOD2的蛋白表达明显下降,Bax/Bcl-2的比值显著升高(P<0.01);4与正常对照组大鼠相比,8周糖尿病大鼠肾脏Sirt3的蛋白和m RNA表达显著升高,12周糖尿病大鼠肾脏Sirt3的蛋白和m RNA表达显著下降(P<0.01)。大鼠肾脏免疫组化染色结果显示,与对照组相比,12周糖尿病大鼠肾脏Sirt3的表达明显下降,且Sirt3主要分布于远曲肾小管细胞,肾小球和肾间质未见明显的表达;5在HK-2细胞,Sirt3的蛋白和m RNA表达于高糖刺激12h时显著增高,当高糖刺激达到48h时,Sirt3的蛋白和m RNA表达显著降低(P<0.01),高糖对Sirt3的改变呈时间依赖性。Sirt3主要分布于细胞质,少量存在于细胞核。第二部分Sirt3对高糖环境下肾小管上皮细胞氧化损伤的影响及分子机制目的:Sirt3是一种核DNA编码的NAD依赖的去乙酰化酶,它是Sirtuins家族中的一员。作为线粒体内主要的去乙酰化酶,Sirt3调控线粒体内多种蛋白的乙酰化水平与活性,影响着线粒体内的多种生物学作用,如呼吸链反应?三羧酸循环?脂肪酸的β氧化、抗氧化通路等,进而影响了细胞的代谢反应、氧化应激以及细胞凋亡等。Sirt3可调控线粒体电子转移链中复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性,从而影响线粒体ROS和ATP的产生。Sirt3通过调控细胞内抗氧化酶SOD2的表达和活性,与三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)相互作用等方式,加快ROS的清除,降低ROS的毒性作用。Sirt3不仅可以影响线粒体的功能还对线粒体的结构具有调控作用。Sirt3可调节线粒体动力学相关蛋白——动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,Drp1)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy1,Opa1)的乙酰化水平和活性,影响线粒体的动力学稳态。在心肌细胞内,Sirt3可去乙酰化亲环素(cyclophilin D,Cyp D)并阻止线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,m PTP)的开放,保持线粒体的内稳态,抑制了细胞的凋亡。近来,研究发现Sirt3还可去乙酰并激活糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β),阻断TGF-β信号通路,抑制组织纤维化的发生。Sirt3可通过其抗氧化应激、抗凋亡等特性抑制多种疾病的发生与发展。第一部分实验提示我们,Sirt3很可能参与了糖尿病肾病的发病,在本部分的实验中,我们将运用质粒转染技术,在体外培养的人肾小管上皮细胞中过表达Sirt3,观察它对高糖环境下肾小管上皮细胞氧化应激及凋亡的影响,并进一步探索可能的分子机制。方法:1检测高糖对HK-2细胞凋亡相关蛋白及Akt/Fox O信号通路的影响:将正常培养的HK-2细胞经同步化处理后,分别给予正常糖浓度培养基(normal control group,5.5 mmol/L D-glucose,NG),高糖培养基(high glucose,30 mmol/L D-glucose,HG)6小时、12小时、24小时、48小时、72小时,并于相应的时间收取细胞用于提取细胞蛋白及RNA,并运用Western blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、Fox O1、p-Fox O1、Fox O3a、p-Fox O3a的蛋白表达。2转染质粒,在HK-2细胞过表达Sirt3:运用不同比例的Fu Gene HD转染试剂与Sirt3质粒转染HK-2细胞找出转染的最佳条件。运用最佳转染条件向HK-2细胞转染Sirt3质粒,并运用Western blot和Real-time PCR检测Flag的蛋白及Sirt3的m RNA表达,验证转染是否成功。3为检测过表达Sirt3对细胞生物学作用和信号通路的影响,将正常条件培养的HK-2细胞分为4组:空载质粒p CMV-vector转染对照组(control)、p CMV-Sirt3质粒转染组(Sirt3)、高糖+空载质粒p CMV-vector对照组(HG+control)、高糖+p CMV-Sirt3质粒转染组(HG+Sirt3)。所有高糖刺激的组别应使用高糖培养基刺激48h。刺激完成后,收集细胞的总蛋白,运用Western blot检测SOD2、catalase、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Bim、Fas L、Akt、p-Akt、Fox O1、p-Fox O1、Fox O3a、p-Fox O3a的蛋白;运用Mito SOX进行细胞染色、电子显微镜摄像技术观察线粒体内ROS水平;运用细胞流式实验技术检测细胞内ROS的水平;运用TUNEL法检测细胞内的凋亡水平;分别提取细胞的核蛋白与质蛋白,运用Western blot检测细胞核与细胞质内Fox O1和Fox O3a的蛋白表达,运用细胞免疫荧光检测Fox O1和Fox O3a在细胞的表达和分布。4为检测抗氧化剂与细胞凋亡及Akt/Fox O信号通路之间的关系,将细胞分为5组:正常糖对照组(NG,5.5 mmol/L D-glucose),渗透压对照组(M,5.5 mmol/L D-glucose+24.5 mmol/L mannitol),高糖组(HG,30mmol/L D-glucose)、NAC对照组(N,5 mmol/L NAC),高糖+NAC组(HG+N,30 mmol/L D-glucose+5 mmol/L NAC)。提取细胞总蛋白,运用Western blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、Fox O1、p-Fox O1、Fox O3a、p-Fox O3a的蛋白;细胞流式实验技术检测细胞内ROS的水平。结果:1 HK-2细胞以Fugene HD 4μl和p CMV6-Sirt3 2μg为比例混合转染时可取得最佳的转染效率;2 Western blot结果显示,与control组相比,高糖干预48 h时,SOD2和catalase在HK-2细胞的蛋白表达量显著下降,Sirt3过表达可以减弱高糖对SOD2和catalase的抑制作用,结果有统计学意义(P<0.01)。Mito SOX染色结果显示,与control组相比,Sirt3过表达降低了高糖刺激导致的线粒体ROS聚集,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞流式实验表明,与control组相比,高糖组细胞内的ROS增加了3倍,而Sirt3的过表达和抗氧化剂NAC明显的减弱了高糖对细胞内ROS的聚集作用,结果有统计学意义(P<0.01);3在HK-2细胞中,与NG组相比,高糖刺激48h时,Bax与Bcl-2的比值以及Cleaved caspase-3的蛋白表达显著增高。与HG组相比,在HG+Sirt3组,Bax/Bcl-2的比值及Cleaved caspase-3、Bim、Fas L的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL细胞染色实验说明Sirt3过表达显著降低了高糖导致的HK-2细胞凋亡;4 Western blot结果显示,与NG组相比,p-Akt(Ser 473)、p-Fox O1(Ser 256)和p-Fox O3a(Ser 253)的表达在高糖刺激48h后明显降低(P<0.01)。与HG+control组相比,Sirt3过表达可以显著增高p-Akt、p-Fox O1和p-Fox O3a的蛋白表达(P<0.05)。与HG+control组相比,Sirt3过表达可显著降低细胞核内Fox O1和Fox O3a的表达(P<0.01)。细胞免疫荧光实验说明,与HG+control组相比,HG+Sirt3组Fox O1和Fox O3a在细胞核的表达显著降低;5 Western blot结果显示,与HG组相比,NAC可以显著降低Bax/Bcl-2的比值和Cleaved caspase-3的蛋白表达,并显著增加Akt、Fox O1和Fox O3a的磷酸化水平,差异有统计学意义(P<0.01)。第三部分山奈酚对高糖刺激下肾小管上皮细胞的保护作用及其机制目的:山奈酚(3,4’,5,7-四羟基黄酮)是一种广泛存在于植物中的多酚类非甾体成分,它是一种天然存在的植物雌激素,具有抗氧化应激、抗凋亡、抗炎等生物学作用。山奈酚广泛存在于茶、花椰菜、豆类、番茄、草莓、葡萄等多种蔬菜与水果中,另外,它也存在于一些传统中医药植物中,如银杏、辣木等。近年的研究发现,山奈酚对氧化应激相关疾病具有保护和治疗作用,如:心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、肥胖等。山奈酚的生物学作用受到了广泛关注,但是关于山奈酚与糖尿病肾病之间关系的研究还非常少,我们推测山奈酚对糖尿病肾病的发生与发展有保护作用,并将在本课题中初步检测山奈酚对高糖刺激下肾小管上皮细胞氧化应激和凋亡的影响。目前,山奈酚发挥生物学作用的分子机制也并不是很清楚,有研究报道山奈酚可以增加Sirt3的表达,本部分研究检测了山奈酚与Sirt3表达之间的关系,并对山奈酚发挥生物学作用的可能分子机制做了初步探讨。1为寻找山奈酚对HK-2细胞的安全、有效浓度,运用MTS实验检测在正常糖浓度和高糖浓度下,不同浓度山奈酚(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、50μmol/L)对HK-2细胞的活力影响。2将正常条件下培养的HK-2细胞分为5组:正常糖对照组(NG,5.5mmol/L D-glucose),渗透压对照组(M,5.5 mmol/L D-glucose+24.5mmol/L mannitol),高糖组(HG,30 mmol/L D-glucose)、山奈酚对照组(KMP,10μmol/L kaempferol)、高糖+KMP组(HG+KMP,30 mmol/L D-glucose+10μmol/L kaempferol)。收集细胞总蛋白和RNA,运用Western blot和Real-time PCR检测Sirt3、SOD2、catalase的蛋白和m RNA表达;运用Western blot方法检测细胞内Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、Fox O3a、p-Fox O3a的蛋白表达;运用TUNEL法检测细胞凋亡;运用细胞流式实验技术检测细胞内ROS的水平;运用SOD酶活性检测试剂盒检测HK-2细胞SOD的活性。方法:结果:1 MTS结果显示,山奈酚的工作浓度为0.01、0.1、1、5、10、15、20μmol/L时,对HK-2细胞的活性没有明显的影响。当山奈酚的工作浓度为50μmol/L时,它会对HK-2细胞的活性产生明显的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01)。与NG组相比,HG组HK-2细胞的活性显著降低。与HG组相比,当10μmol/L的山奈酚与高糖共同作用于HK-2细胞时,HK-2细胞的活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。综合以上的实验结果,我们选用10μmol/L的山奈酚作为后续实验的使用浓度;2 Western blot结果显示,与NG组比,高糖显著降低了抗氧化蛋白SOD2和catalase的蛋白和m RNA表达(P<0.05)。与HG组相比,在HG+KMP组,SOD2和catalase的蛋白和m RNA表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。SOD活性测试实验表明,与HG组相比,10μM山奈酚可以显著增加SOD的活性,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞流式实验表明,与高糖组相比,山奈酚可以显著降低HK-2细胞中的ROS水平,差异有统计学意义(P<0.01);3 Western blot结果显示,在HK-2细胞,与NG组相比,高糖显著增加了Bax/Bcl-2的比值及Cleaved caspase-3的表达。而在KMP+HG组,山奈酚显著抑制了高糖对Bax/Bcl-2及Cleaved caspase-3的增加作用,差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL实验结果表明,山奈酚可以显著降低高糖环境下HK-2细胞的凋亡;4 Western blot和Real-time PCR的实验结果显示,在HK-2细胞,与HG组相比,山奈酚可以显著抑制高糖对Sirt3的降低作用,差异有统计学意义(P<0.01)。HK-2细胞的免疫荧光染色结果表明,与高糖组相比,山奈酚可以显著增加Sirt3在HK-2细胞的表达;5 Western blot的结果显示,在HK-2细胞,与NG组相比,高糖显著降低了Akt和Fox O3a的磷酸化水平。与HG组相比,在HG+KMP组,山奈酚显著增加了p-Akt/Akt和p-Fox O3a/Fox O3a的比值,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1在糖尿病大鼠肾组织及高糖培养的HK-2细胞中Sirt3的表达下降,且与SOD2、Bax/Bcl-2的变化趋势相一致,提示Sirt3可能参与了糖尿病肾损伤的过程。2 Sirt3过表达可以显著降低高糖刺激下HK-2细胞的氧化应激和凋亡。3 Sirt3可通过ROS敏感的Akt/Fox O信号通路发挥其抗凋亡作用。4山奈酚干预可降低高糖刺激下HK-2细胞的氧化应激和细胞凋亡。5山奈酚可通过增加Sirt3的表达以及调控ROS敏感的Akt/Fox O3a信号通路发挥其抗氧化及抗凋亡作用。