论文部分内容阅读
2011年至今全国范围内爆发的由病毒感染而导致的仔猪腹泻,给养猪业造成了巨大的经济损失,其中包括猪A群轮状病毒(group A porcine rotavirus,GARV)、猪 C 群轮状病毒(group C porcine rotavirus,GCRV)和猪星状病毒(porcine Astroviridae,PAstV)。为了调查A、C群轮状病毒和星状病毒在四川地区猪群中的感染率和分子遗传特征,掌握猪GARV、GCRV和PAstV的流行状况,为进一步研究这三种肠道疾病预防控制技术提供依据。本研究建立了三种病毒的多重RT-PCR检测方法,对四川爆发仔猪腹泻的猪群进行了 GARV、GCRV和PAstV的检测并对其进行了分子流行病学研究,取得了以下进展:1 GARV、GCRV和PAstV的多重RT-PCR检测方法的建立参考GenBank中收录的相关序列对这三种病毒基因区进行同源性分析,选取GARV、GCRV的VP6基因和PAstV的ORF2基因为目标基因。然后使用Primer 5.0分别针对三个目标基因设计特异性引物,预计扩增片段大小分别为229bp、166bp和410bp。先分别建立针对各病毒的单项RT-PCR方法。在此基础上优化反应条件和反应程序,建立了 GARV、GCRV和PAstV的多重RT-PCR检测方法。建立的多重RT-PCR方法,能从GARV、GCRV、PAstV阳性模板中同时扩增出与目的片段大小相符的3条特异性条带,而以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌均不能扩增得到特异性条带;能扩增出GARV、GCRV和PAstV cDNA最低模版浓度分别为5.47×10-4μg/μL、3.8×10-3μg/μL和4.8×10-4μg/μL;对同一阳性模版随机进行三次检测,能够得到一致的结果。表明本方法的具有很好的特异性、敏感性和重复性。与单项RT-PCR检测结果符合率分别为100%、100%、96.7%,整体符合率达98.9%。结果表明,本实验建立的多重RT-PCR检测方法具有快速、准确的特点,可用于GARV、GCRV和PAstV的检测。2多重RT-PCR检测方法的临床应用运用建立的多重RT-PCR方法对覆盖四川主要生猪产区,来自不同猪场有腹泻症状的115份腹泻粪样进行检测,统计分析结果发现其中23份检出GARV,4份检出GCRV、14份检出PAstV,感染的阳性率分别为20%、3.47%、12.17%;8份检出GARV和PAstV混合感染,2份GARV和GCRV混合感染,仅1份样品同时检出三种病毒;冬季为三种病毒主要流行的季节,2月龄以下为主要感染猪群,遂宁德阳地区的感染情况较为严重。3 GARV、GCRV和PAstV的分子流行病学分析根据115份病料中阳性样品的克隆测序结果,进行四川地区GARV、GCRV和PAstV的分子遗传多样性分析。结果显示,四川地区的流行的GARV毒株之间同源性在88.5%～95.4%,与猪源参考株AF317123的同源性最高,达到88.7%～92%。遗传进化分析表明中国猪A群轮状病毒GD株和猪A群轮状病毒ZZ-12只同一分支,亲缘关系接近。GCRV毒株的同源性达到88.7%～95.5%,与猪源参考株EU002785的同源性在89%～93%之间,与南韩猪C群轮状病毒CUK-5分离的毒株位于同一分支;PastV流行株主要是2型和5型,PAstV2型的组内同源性达到97.7%～99.5%,PastV5型的组内同源性达到87.2%～98.8%,2型毒株与PoAstV/Krv7/cro同源性在87.9%～89.2%之间。5型毒株与其他5型毒株同源性达到77%～92%,与克罗地亚分离株亲缘关系较为接近。这些研究结果将丰富四川地区ARV、GCRV和PastV分子流行病学资料及相关疫病的防控策略制定的科学依据。