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目的:肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,c-met)对细胞增殖、分化、形态发生和浸润运动等均有调节作用,与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关。本实验通过模拟人体实体肿瘤低氧环境,检测人喉鳞癌细胞系Hep-2细胞的增殖、凋亡以及c-met、HIF-1a(hypoxia-inducible factor1,HIF-1)蛋白表达,旨在探讨低氧对喉癌Hep-2细胞c-met蛋白表达及细胞增殖的影响,从而为肿瘤的发生机制及抗肿瘤靶向治疗提供理论依据与实验基础。方法:1.细胞培养环境处理:低氧培养条件为37℃、5%CO2、2%O2、93%N2、饱和湿度,对照常氧培养环境为37℃、5%CO2、20%O2、75%N2、饱和湿度。2.免疫细胞化学鉴定人喉癌Hep-2细胞表面c-met蛋白的表达。3.流式细胞检测喉鳞状细胞系Hep-2低氧以及常氧6h、12h、24h、36h c-met、HIF-1a蛋白的表达情况及细胞凋亡率的变化。4.应用MTT法检测低氧组与常氧组6h、12h、24h、36h细胞增殖率的不同,加入40ng/ml HGF组与不加HGF组6h、12h、24h、36h细胞增殖率的不同。结果:1.通过免疫细胞化学方法检测,与阴性对照组相比,实验组细胞膜上可见黄褐色颗粒,为c-met蛋白显色,证明人喉鳞癌细胞系Hep-2细胞表面有c-met蛋白表达。2.应用流式细胞仪检测常氧6h、12h、24h、36h c-met蛋白FI分别为:1.062±0.087、1.057±0.034、1.082±0.018、1.111±0.056;低氧6h、12h、24h、36h c-met蛋白FI分别为:1.079±0.042、1.088±0.036、1.167±0.058、1.109±0.029;常氧6h、12h、24h、36h HIF-1a蛋白FI分别为:1.002±0.027、1.119±0.021、1.140±0.030、1.161±0.065;低氧6h、12h、24h、36h HIF-1a蛋白FI分别为:1.163±0.072、1.214±0.011、1.268±0.011、1.149±0.085。HIF-1a与c-met蛋白表达均在低氧6h、12h、24h逐渐升高,24h为高峰,24h至36h逐渐下降;两个蛋白在常氧环境下表达稳定,无时间依赖性;HIF-1a于低氧6h、12h、24h、36h蛋白表达均比常氧明显增强,c-met于12h、24h蛋白表达比常氧增强。说明低氧可促进HIF-1a与c-met蛋白表达。HIF-1a与c-met蛋白在低氧6h、12h、24h呈正相关(r=0.710,p<0.05),且HIF-1a的表达优先于c-met,说明c-met受HIF-1a的调节。3.常氧与低氧细胞增殖率均呈逐渐升高趋势,无HGF的常氧组与低氧组6h、12h、24h、36h各时间点下比较于24h有显著差别(p<0.01),6h、12h、36h无差异;常氧条件下各时间点组之间两两比较均有显著差异(p<0.01),低氧条件下各时间点组之间两两比较也均有显著差异(p<0.01)。细胞增殖率与HIF-1a蛋白于低氧6h、12h、24h呈明显正相关(r=0.811,p<0.01)。表明低氧可促进细胞增殖,且细胞增殖率可随时间延长逐渐增高。4.常氧HGF(40ug/L)组及低氧HGF(40ug/L)组细胞增殖率均随时间延长逐渐升高。常氧条件下,无HGF组与HGF40ug/L组于12h有差异(p<0.05),24h有显著差异(p<0.01);低氧条件下,无HGF组与HGF40ug/L组于24h有显著差异(p<0.05)。细胞增殖率与HIF-1a蛋白于低氧6h、12h、24h呈正相关(r=0.682,p<0.05)。说明HGF/c-met可促进细胞增殖,且细胞增殖率可随时间延长逐渐增高。5.常氧条件下,6h、12h、24h、36h各时间点之间细胞凋亡率无明显差别(p>0.05);低氧条件下,6h、12h、24h之间两两比较无明显差别,36h与6h、12h、24h之间有差别,于36h凋亡率有升高趋势;常氧6h、12h、24h凋亡率与低氧6h、12h、24h相比统计学差异显著(p<0.01),低氧细胞凋亡率于6h、12h、24h较常氧状态下低,常氧36h凋亡率与低氧36h相比有统计学差异(p<0.05),低氧细胞凋亡率于36h较常氧状态下高。表明低氧能够抑制细胞凋亡,但在一定的条件下还可以促进细胞凋亡。结论:1.人喉鳞癌细胞系Hep-2细胞表面确实有c-met蛋白的大量表达。2.体外实验控制细胞低氧生存环境,低氧可以促进肿瘤细胞HIF-1a及c-met蛋白的表达,常氧环境下两种蛋白表达相对稳定,并且低氧可能通过提高HIF-1a基因转录水平的表达而调节c-met基因的表达,c-met蛋白表达水平随HIF-1a升高而升高,二者呈正相关,但HIF-1a的表达优先于c-met,随着时间的延长,后期细胞长期持续缺氧出现两种蛋白表达的下降。3.低氧条件下细胞的增殖率较常氧明显升高,HIF-1a于低氧下表达活跃,且低氧下细胞增殖率随HIF-1a蛋白表达的增加而升高,说明低氧能够促进人喉鳞癌细胞系Hep-2增殖,且在此促进过程中HIF-1a起到了重要作用。4.通过外来给予HGF干预,刺激Hep-2细胞表达c-met蛋白增加,发现无论在常氧环境还是低氧环境下加入HGF的细胞增殖率都有升高,说明HGF/c-met可以促进细胞增殖。而且在低氧环境下,细胞的增殖率随c-met蛋白表达的增加而升高,进一步说明了c-met蛋白可以促进Hep-2细胞的增殖。5.低氧条件下Hep2细胞凋亡率明显低于常氧,说明低氧能够抑制细胞凋亡;但长期持续的低氧导致晚期出现细胞凋亡率的升高,且高于常氧,说明低氧同样可以促进细胞凋亡。