革兰氏阴性（G^-）菌感染引起的脓毒症（sepsis）是重症监护病房（intensivecare unit,ICU）常见的致死原因。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是G^-菌细胞壁的主要成分,也是其致病的关键成分。由于LPS的识别和信号转导是宿主对G^-菌发生防御反应的关键,所以对LPS信号转导的研究一直是相关领域的热点。研究发现,血浆中的LPS首先和LPS结合蛋白（LPS binding protein,LBP）结合,LBP募集并将LPS转运到CD14（cluster of differentiation-14）。CD14能结合并聚集LPS信号,但由于它缺乏跨膜区和胞浆内段,不能将LPS信号转导到细胞内,因此人们推测存在一个或多个跨膜受体转导LPS信号。随后的研究发现TLR4是跨膜转导LPS信号的主要受体。目前已知TLR4介导的信号转导包括髓样细胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）依赖性和非依赖性途径。MyD88依赖性途径主要介导NF-κB活化、细胞因子的产生,而MyD88非依赖性途径主要负责LPS诱导的IFN诱导性蛋白10（IFN-inducible protein10）、糖皮质激素终止反应基因16（glucocorticoid attenuated respinse gene16,GARG-16）、IFN调节基因1（IFN-regulated genel,IRG-1）表达和树突状细胞成熟。虽然TLR4是LPS跨膜信号转导的主要受体,但在体外转染了TLR4的人胚肾细胞（human embryonic kidney-derived 293 cell line,HEK293）和Ba/F3细胞（amouse IL-3-dependent pro-B cell line）不能转导LPS信号。随后的研究发现TLR4介导的LPS信号转导需要一种称为髓样分化蛋白-2（myeloid differentiation-2,MD-2）的辅助。MD-2蛋白由160个氨基酸组成,相对分子量为25-30 kD,其N端有一段由16个氨基酸残基组成的信号肽,使MD-2具有分泌性。MD-2广泛分布于造血系统、神经系统和生殖系统,B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等都有MD-2表达。研究发现,MD-2合成后大部分在内质网/高尔基体与TLR4结合,然后以TLR4/MD-2复合物的形式在细胞表面表达,参与LPS信号的识别和转导。目前认为,TLR4并不与LPS直接结合,而是通过MD-2的协助将LPS的信号转导到细胞内。MD-2如何协助TLR4传递LPS信号,MD-2与TLR4相互作用的结构域是什么一直是相关领域的研究热点。早期研究认为影响MD-2与TLR4结合的主要结构是Cys⁹⁵和Cys¹⁰⁵两个半胱氨酸残基,但近年来研究发现MD-2的Cys³⁷-Cys⁵¹袢环和Cys⁹⁵-Cys¹⁰⁵袢环及周围一些位点都有可能参与TLR4的结合。同样,对TLR4与MD-2作用的结构域也尚不明确,最近有研究认为TLR4N端的氨基酸可能是结合MD-2的区域。由此可见,我们对细胞识别LPS信号的机制的认识还十分有限,所获得的结果尚存在争议,这可能与不同实验室用不同的实验方法进行研究有关。另外,由于这些研究采用的都是体外实验,所以无法获得MD-2与TLR4相互作用的直接证据。基于以上认识,本课题采用荧光共振能量转移技术（Fluorescence resonanceenergy transfer,FRET）在活体细胞研究TLR4与MD-2之间的关系,以期得到确切的结果。FRET被认为是研究活体细胞内蛋白-蛋白相互作用最好的方法之一。相比于传统研究蛋白质相互作用的方法,例如免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）和亲和层析（affinity chromatography）,FRET不需要破碎细胞,能保留蛋白质在完整细胞中所具有的正常生理条件,并且能提供相互作用蛋白质空间分布的信息;与免疫化学共定位相比,FRET能直接说明特定蛋白质之间是否发生了相互作用。由于这些特点,FRET成为目前研究活体细胞内蛋白质相互作用最可靠的方法之一。FRET是指当两荧光分子距离足够近时（通常在10 nm以内）,激发供体分子受体分子发射出荧光。根据这一原理,我们可以用FRET来研究蛋白质分子之间的相互作用。一对理想的FRET荧光基团,要求供体的发射光谱和受体的吸收光谱有明显的重叠,同时供体的发射光谱和受体的发射光谱要完全分开。青色荧光蛋白（cyan flurescent protein,CFP）和黄色荧光蛋白（yellow flurescent protein,YFP）是目前常用的一对荧光基团,完全满足以上要求,并且其R_o为4.9 nm,可以在7.8 nm范围内进行FRET测定。目前,显微镜测定FRET的方法基本可以分为两大类:一类是基于荧光强度的方法,另一类是基于荧光动态衰减的方法。我们采用的是基于荧光强度的三通道FRET计算,这主要适用于活细胞的FRET研究。理论上,准确进行三通道FRET定量测量必须要进行一定的校正,主要包括三个方面:FRET滤光片检测到的非FRET成分,荧光串色（用CFP滤光片检测到受体荧光分子信号或YFP滤光片检测到供体荧光分子信号）及供受体表达浓度的影响。针对这三个方面,我们采用以下方法进行校正。在滤光片的选择上,我们采用了德国Carl Zeiss公司的滤光片组:CFP、YFP、CFP-YFP-FRET,它们能有效削减光谱串色,提高FRET信号的信号噪声比。由于荧光串色的量与荧光蛋白的表达浓度成正比,而蛋白表达浓度又与最佳曝光时间成反比。为了消除荧光串色的影响,我们将CFP和YFP分别表达,计算出供体/受体校正因子（Donor/Acceptor Correction Factor）。我们采集并计算了100个不同最佳曝光时间细胞的供体校正因子,运用SPSS13.0软件将得到的供体校正因子和曝光时间做曲线估计分析（Curver Estimation）,得出供体校正因子和曝光时间的最佳计算方程为:供体校正因子=19.6766+0.025X曝光时间-0.00003X曝光时间²+0.000000012X曝光时间,相关系数为0.822。我们同时计算了数十个不同最佳曝光时间下的受体校正因子,结果均为0,说明我们选择的滤光片能有效削减YFP和FRET通道的光谱串色。为了比较不同细胞间的FRET值,消除供受体表达浓度对FRET计算的影响,我们采用了Xia的方法进行FRET标准化计算。Xia的方法将去除背景和串色得出的FRET灰度值除以供体和受体信号的平方根,能有效减少供体和受体表达浓度对FRET值的影响。在此基础上,我们将CFP和YFP以15个中性氨基酸相连的融合蛋白CY-15P作为检测目标,将共同表达的CFP和YFP蛋白作为系统的阴性对照,各取二十个细胞,用AxioVision FRET 4.6软件进行数据采集和Xia的方法进行FRET值计算,结果获得了较高的FRET值,并且与阴性对照组相比有统计学意义,证明FRET系统建立成功。为了研究MD-2与TLR4的相互作用结构域,我们将MD-2 Cys⁹⁵-Cys¹⁰⁵袢环周围5个可能与TLR4作用的氨基酸Arg⁹⁰、Lys⁹¹、Asp⁹⁹、Asp¹⁰⁰和Tyr¹⁰²分别突变为Ala。将5个MD-2的突变体在HEK293细胞分别表达或分别与TLR4共表达,结果表明分别突变这5个氨基酸不影响MD-2和TLR4的表达。同时我们选取CFP-MD-2R90A与YFP-TLR4共表达,研究突变对其结合TLR4的影响,FRET结果显示MD-2R90A突变并不影响和TLR4的结合。同时为了研究TLR4与MD-2作用的结构域,本课题构建了TLR4N端18个氨基酸(Glu²⁴-Met⁴¹)缺失的突变体,在HEK293细胞上比较MD-2与野生型TLR4及MD-2与TLR4突变体间的FRET值。结果表明N端Glu²⁴-Met⁴¹缺失的TLR4结合MD-2的能力明显下降,Glu²⁴-Met⁴¹很可能是TLR4结合MD-2的区域。为了进一步研究N端Glu²⁴-Met⁴¹缺失对TLR4聚合的影响,在Hela细胞,我们将野生型TLR4和TLR4突变体各自与CFP和YFP融合表达,检测LPS刺激下TLR4间FRET值的变化。实验表明野生型TLR4在LPS刺激下,在1 min到2 min有一过性的FRET增强,随后这种结合迅速减弱,在5 min左右消失;而N端Glu²⁴-Met⁴¹缺失的TLR4突变体则没有观察到FRET现象。这说明TLR4 N端的Glu²⁴-Met⁴¹突变还可能影响TLR4的聚合,但这种作用是通过影响与MD-2的结合导致,还是直接由于这段区域参与TLR4聚合,还需要进一步的实验研究。综上所述,我们利用Carl Zeiss活细胞影像系统成功建立了FRET技术平台,并利用该系统发现TLR4N端的Glu²⁴-Met⁴¹很可能是结合MD-2的区域。同时通过检测LPS刺激下FRET值的变化,发现TLR4 N端的Glu²⁴-Met⁴¹还参与TLR4的聚合作用。另外我们发现MD-2的Arg⁹⁰、Lys⁹¹、Asp⁹⁹、Asp¹⁰⁰和Tyr¹⁰²五个位点突变不影响MD-2及TLR4的表达,MD-2 R90A突变不影响和TLR4的结合。此外,我们成功筛选出稳定表达YFP-TLR4的HEK293-YFP-TLR4细胞系,为进一步阐明MD-2与TLR4的作用机制打下了基础。本课题的研究将对丰富LPS受体的基本理论,细菌性感染和内毒素休克的救治提供新的思路。